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1、间接法 ELISA SOP 一、包被 1抗原包被量为20 g/板。 2例如：抗原浓度为0.8mg/ml 。 3取 25 l 抗原与 20mlCBS（抗原包被液）混匀，100 l/孔。 4包被完毕后，4过夜。 二、封闭 1从 4冰箱中取出酶标板，甩干包被液，拍板。 2加封闭液，200 l/孔。 337孵育 2h。 4甩干，洗板（3 次） 。 5用干燥的自封袋4保存。 【注】 ：洗板，将孔内液体甩出，每孔加200 l -300 l 洗板液，静置2min，甩出，将板拍在 干的纱布上，将孔内液体拍干为佳。 三、一抗 1可洗板一次。 2阳性对照：1 l 阳性血清加入1ml 抗原稀释液中，做1：1000
2、稀释（第一孔） 。 3阴性对照：做1：2 万稀释。 用 1 l 阴性血清加入100 l 抗原稀释液中，先做1：100 稀释。再从此液 取出 5 l 加入 995 l 的抗原稀释液中，最终稀释为1：2 万。 4空白对照：只加抗原稀释液。 5除第一孔和阴性对照孔外，每孔加100 l 抗原稀释液。 6第一孔加100 l（1：1000）的阳性对照。 7第二孔加100 l（1：1000）的阳性对照，吹打混匀，再从二号孔中吸取100 l 加到 3 号 孔中，做倍比稀释，最后两孔为阴性对照或空白对照。 1：1000 1：2000 1：4000 1：8000 1：16000 1：32000 阴性对照（ 1：2
3、 万） 空白对照 8将酶标板37孵育 1h，洗板 3 次。 【注】 ：通常在第一次做Elisa 时，应该做阴性对照的梯度稀释，从中选择最佳的稀释倍数 (一般认为吸光值小于0.1 的阴性稀释倍数为易)。 更为严格的操作是，阳性，阴性，空白的对照空均为双复孔或三复孔。 在稀释一抗，或者二抗的时候，要算好每次的用量。 四、二抗 本次检测采用二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 1用 0.01MPBS 做 1：5000 稀释（现用现配） 。 2100 l/孔。 3酶标板37孵育 30min, 洗板 3 次。 【注】 ：采用的二抗的所抗的物种应当与一抗的来源相一致，例如一抗是兔多抗，那么二抗 就应该选
4、择羊抗兔或者是其他种属抗兔的酶标二抗。 五、显色 1显色液参照底物配制表。 总体积 (ml) 10 8 6 4 2 A+B混合液 (ml) 10 8 6 4 2 TMB (ml) 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.75%H2O2 ( l) 32 25.6 19.2 12.8 6.4 2100 l/孔。 3酶标板37孵育 15min，不洗板，直接加终止液。 【注】 ：最后显色阳性、阴性、空白都没有一点颜色，很有可能是二抗或者显色剂出了问 题。其次还有可能是包被或封闭出了问题，那最后只能是一抗不能和抗原结合了（可 能性较小）。 最后显色阳性、阴性、空白都有颜色，可能是，（1）阳性的显色结
5、果是非特异结 合； （2）阴性稀释不够，或者本身阴性血清就含有可以和抗原结合的物质（动物的 个体差异造成） ； （ 3）洗板没洗干净，可以增加洗板次数和时间，提高洗板效果。 出现“跳孔”即，抗体的吸光值并不是根据稀释梯度逐级递减，可能是在做梯度 稀释的时候出现了失误（一般新手的较易出现这种情况）。 六、终止 终止液为2M 的 H2SO4。 100 l/孔，终止后立即用酶标仪检测，波长为450nm 下记录实验结果。 分析抗体效价。 如， 稀释倍数抗体 1:500 3.138 1:1000 2.957 1:2000 2.351 1:4000 1.644 1:8000 1.047 1:16000 0
6、.611 阴性 1：2 万0.096 空白0.094 【注】 ：我们把抗体的吸光值大于1 的稀释倍数，认定为有效加的。最接近1 的那个稀释倍 数为该抗体的效价。如本图，该抗体的效价为1:16000 。 我们的认定方法和教科书上规定的方法不同，但是教科书上的方法过于理想化，根 据普遍的各个实验室的实际经验来看，我们才采用了上述方法来判定抗体的效价。 附录 1 ELISA 液配方 包被液【 10CBS】 （pH9.6）配制量1L 配制方法1.称量下列试剂，置于1L 烧杯中。 2.调节 pH 值至 9.6，dH2O 定容至 1L 。 3.4保存。 抗原量： 200ng/孔， 20ug/板。 一抗稀释
7、液（封闭液）配制量100ml 配制方法1.称量下列试剂。 2.dH2O 定容至 100ml。 3.注：吐温较为粘稠，用枪吸取时要多停留一会儿。 4.4保存。 二抗稀释液【 0.01MPBS 】 0.1MPBS(PH=7.2) 配制量1L 配制方法1.称量下列试剂。 2.调节 pH 值至 7.2，dH2O 定容至 1L。 3.常温保存。 Na2CO315.9g 150mM NaHCO329.3g 350mM 牛血清白蛋白（BSA）1g 吐温 -20 0.1M PBS 0.05ml 10ml NaH 2PO42H2O 2.83g Na2HPO412H 2O NaCl 28.98g 85g 显色液
8、A+B 混合液配制量50ml 配制方法1.称量下列试剂。 2.dH2O 定容至 50ml。 3.4保存。 TMB 【四甲基联苯胺】 配制量10ml 配制方法1.称量下列试剂。 2.4保存。 0.75%H2O2配制量400 l 配制方法10 l 30%H2O2+390l dH2O 注：显色液混合时，现用现混。0.75%H2O2现用现配。 终止液【 2M 浓 H2SO4】配制量1L 配制方法1.110ml 浓 H2SO4+890ml dH2O 2.常温保存。 10洗板液配制量1L 配制方法1L 0.1M PBS+5ml 吐温 -20 附录 2 试剂及仪器厂家 酶标板（ 96 孔）Corning 酶
9、标仪的Thermo 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔中杉金桥 附录 3 ELISA 的基本原理 柠檬酸 (A)0.47g Na2HPO412H2O(B) 0.73g TMB20mg 无水乙醇10ml ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的 抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活 性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。 用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记 的抗原或抗体， 也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的
10、量 呈一定的比例。 加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检 物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间 接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。 原理就是用已知的抗原包被酶标板，经过封闭后， 加入待检抗体， 再加入抗待检抗体的 抗体（抗抗体，即二抗，例如，抗兔免疫球蛋白IgG 抗体） ，这个二抗是商品化的，是用一 抗做抗原免疫实验动物而制得的，试剂公司都有卖的，往往用碱性磷酸酶（AP）或辣根过 氧化物酶 （HRP）标记， 实验的结果在最后加入该标记酶的底物溶液后通过显色来判断阴性 或阳性。抗体结合抗原的位点是Fab
11、 端，待检IgG 的 Fab 端就和已知的包被抗原结合，Fc 端游离，加入的二抗就通过其Fab 端与 IgG 的 Fc 端结合。 分子式 CH4N2O 分子量60.06 分子式H2O2 ， 分子量34.01 分子式 CO(NH2)2 H2O2 分子量 . 47% 过氧化尿溶液 样品名称及稀释倍数过氧化尿素加入量OD值 兔-anti-G 1：1000 3.2ul 1.843 1：1000 6.4ul 1.960 1：1000 12.8ul 1.796 1：1000 19.2ul 1.804 1：1000 25.6ul 1.691 1：1000 32ul 1.687 1：1000 38.4ul 1
12、.603 空白对照38.4ul 0.093 ELISA 显色系统配制试验 显色 A 液 总体积 (ml) 5 显色缓冲液 (ml) 4.5 TMB (ml) 0.5 显色 B 液 总体积 (ml) 5 显色缓冲液 (ml) 5 1.175%过氧化脲 ( l) 32 此显色溶液放于4冰箱中可长期使用。 显色液 显色缓冲液（A+B 混合液）配制量50ml 配制方法1.称量下列试剂。 2.dH2O 定容至 50ml。 3.4保存。 TMB 【四甲基联苯胺】 配制量10ml 配制方法1.称量下列试剂。 2.4保存。 1.175%过氧化脲配制量400 l 配制方法10 l 47%过氧化脲 +390l dH2O 柠檬酸 (A)0.47g Na2HPO412H2O(B) 0.73g TMB20mg 无水乙醇10ml