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1、病理复习 1. 请结合自己的专业，简单设计一个免疫组织化学标记的方案来研究一个课题. （一抗和二抗的名称和来源、一 抗的定位预测；实验方案、生物学意义和临床意义、实验设计（每个对照组的意义）、结果判断。 一抗：抗大细胞肺癌单克隆抗体） 二抗：HRP酶标兔抗大细胞肺癌单抗抗体 一抗的定位预测：表达在细胞浆中 实验方案：选择正常卵巢组织、卵巢良性肿瘤、卵巢恶性肿瘤组织三组石蜡标本切片。通过 抗体标记STK15 （Aurora-a ）,经过免疫组化染色后根据染色颗粒的强度与分布来判定Aurora-a在细胞浆中的 表达结果。 生物学意义：Aurora-a在人类多个肿瘤细胞系内被发现过度表达，是一种与中
2、心体异常密切 相关的基因，其过度表达导致中心体过度复制，从而引起染色体分离异常，导致细胞分裂阻 滞，形成异倍体，引起抑癌基因的缺失或癌基因的获得或激活，从而引起细胞恶性转化，促进肿瘤的发生。 临床意义：Aurora-a的异常可能与恶性肿瘤的病理特点、临床分期、及预后有某些相关性。 它在早期肿瘤中均有阳性表达，表明Aurora-a蛋白水平的改变在卵巢癌中是常发事件，可 能代表了卵巢癌的早期病变，在卵巢癌的发病中起重要作用。抑制Aurora-a激酶的活性有 可能成为一个治疗肿瘤的有效手段。 实验设计：通过设立卵巢恶性肿瘤、卵巢良性肿瘤和正常卵巢组织的对照组，对比各组所研 究Aurora-a在不同组
3、织中表达的差异，进而得出实验结论。 结果判断：采用S-P免疫组化染色后，利用电脑的病理图文报告分析系统进行结果判读，对 染色结果定量分析，记各组织片内肿瘤细胞Aurora-a蛋白的表达情况。 2免疫组化的应用范围：（1）提高病理诊断准确性（2）对疾病的预后和治疗的意义 （3）癌基因蛋白的应用（4）对肿瘤增生程度的评价ki67 PCNA （5）微小病灶的 发现微小癌微小病灶（如羊水栓塞）（6）在肿瘤分期上的意义（7）指导肿瘤治疗 3. ABC复合物： ABC法是利用卵白素与生物素特有的高度亲和力这一生物学性 质，先将生物素与辣根过氧化物酶（HRP ）结合，形成生物素化HRP,然后与卵 白素按一定
4、比例混合，形成ABC复合物。卵白素 - 生物素 -过氧化物酶复合物。 4.何谓抗原修复组织在制作过程中，由于化学试剂的作用封闭了抗原，又 由于热的作用致使部分抗原的肽链发生扭曲，致使在免疫组化的染色过程中不能将其显示出来，为了解决上述 的问题，利用化学试剂和热的作用将这些抗原重新暴露出来或修正过来的过程称为抗原修复。 5.掌握免疫组化在临床上应用的初步方案。A：已知 的特异性抗体或抗原能特异性结 合。B：通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂，如酶，金属离子、同位素等，显示一定的信 号（如：颜色）。C：借助显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察其颜色变化，从而在抗原抗体结合部位确 定组织
5、、细胞结构。 6. “套餐式”免疫标记：免疫组织化学技术以抗原抗体反应为其理论基础，对肿瘤的 诊断和鉴别诊断有重要作用。目前常用抗体分为上皮性、间叶组织、神经及神经内分泌、 淋巴细胞标志物等四类。由于肿瘤类型极多，部分肿瘤的诊断和分型又极其困难，因此 诊断一些肿瘤的免疫组化方案必须是“套餐式”的，即每一种组织的标记物必须用2种 以上的抗体，除了能够阳性正面证实的抗体，还要有能阴性反面证实的抗体。 例如：a. Keratin,Vimentin,LCA,S100 四种抗体组合，Keratin阳性且其它阴性的结果 可以筛选出可疑癌或生殖细胞瘤；Vimentin和LCA阳性的结果可以筛选出可疑淋巴瘤；
6、 Vimentin和S100阳性的结果可以筛选出可疑神经内分泌肿瘤；Vimentin阳性的结果可以筛 选出可疑肉瘤。 b.在Keratin阳性的肿瘤中，CK17和CK18阳性的结果提示移行细胞癌和某 些管状腺癌；CK17阳性和CK18阴性的结果提示鳞癌、皮肤、鼻咽、食道癌等；CK17阴 性和CK18阳性的结果提示腺癌。 7.分子病理学临床应用的进展，举例说明。临床 病理学的发展趋向：三段式诊断： 形态学诊断 +免疫学标记 +分子诊断。在经典病理学的基础上，采用现代辅助手段，提高 病理诊断率和预测（预后）率。临床分子病理学常用方法：免疫组织化学，基因克隆性重 排的检测，FISH及CGH,等位基因
7、不平衡分析，杂合性缺失（LOH）的检测，微卫星DNA 不稳定性（MSI）的检测。I. TUNEL- 免疫组化在细胞凋亡检测中的应用; 化多重标记的应用，临床上IgH和TCR基因单克隆检测在淋巴瘤的分子诊断中普遍应用。 当前分子病理学技术在临床的实际应用：肺癌的分子病理学（60%?85%的NSCLC-腺癌 细胞存在EGFR突变/ 过表达，这部分患者接受肿瘤分子靶向治疗（EGFR抑制剂）的临 床疗效优于常规化疗），胃肠道间质瘤（GIST ）的分子病理学（C-kit 突变是目前普遍认 可的确定GIST的特异敏感指标） , 乳腺癌的分子病理学（30%的浸润性乳腺癌和70%的 导管原位癌存在Her-2基
8、因过表达。Her-2阳性同时预示着肿瘤对内分泌治疗和常规CMF 方案相对耐药。注射用曲妥珠单抗（Herceptin ）是第一个用于治疗Her-2 FISH阳性乳腺 癌患者的分子靶向药物。），结直肠癌的分子病理学（对K-ras基因第二、三外显子（包 括12号、13号、61号密码子）突变位点进行检测，为结直肠癌患者提供准确可靠的用药指导。），恶性淋 巴瘤的分子病理学（许多淋巴瘤治疗相关的靶点、通路，也相应地研制出了许多针对相应靶点和通路的药物。 2 ?免疫组 ） 随着人类基因组计划的实施，通过基因组测序、蛋白质序列和结构解析等实验，分子生物学家提 供了大量的有关生物分子的原始数据，需要利用现代计算
9、技术对这些原始数据进行收集、整理、 管理以便检索使用 , 因而岀现了生物信息学。生物信息学是多学科的交叉产物，涉及生物、数学、物理、 计算机科学、信息科学等多个领域。狭义的讲，生物信息学是对生物信息的获取、存储、 分 析和解释；计算生物学则是指为实现上述目的而进行的相应算法和计算机应用程序的开发。这两门学科之间没 有严格的分界线，统称为生物信息学。 9?结合自己专业，利用生物信息学，查找XX （疾病 +基因）在国内外的研究现 状。写出结论。 有关子宫颈腺癌与鳞状细胞癌中TP53基因突变的系统回顾 人类TP53基因定位于17号染色体p13,全长16kb-20 kb,含有11个外显子，转录2.8
10、kb 的mRNA,编码蛋白质为P53,是一种核内磷酸化蛋白。TP53是迄今为止发现的与人类 肿瘤相关性最高的基因。过去一直把它当成一种癌基因，直至1989年才发现起癌基因作用的是突变的P53,后来证 实野生型P53是一种抑癌基因，在正常情况下，细胞中野生型 P53蛋白的含量很低，且半衰期极短，所以很难检测出来。一直以来，TP53基因都是生物 学界研究的热点，有关野生型的TP53基因的抑癌作用和突变型的TP53的致癌功能，已 经得到公认。众多临床证据17也显示TP53基因突变与多种恶性肿瘤的不良预后有关。尽 管如此，突变的TP53在肺癌中的意义尚不明确。Ding等18发现45%的肺腺癌患者的TP
11、53 基因存在突变，TP53突变是肺腺癌患者不良预后的一个重要因素 Ding L, Getz G , W heeler DA, et al. Somatic mutations affect key pathw ay s i n lu ng adenoc a rc i noma . Nat u re, 2 0 0 8,455(7 216): 1069-1075 ?生物信息学 TP53在OMIM基因定位于17p13.1 10?简述淋巴细胞克隆性重排的概念及其应用。通常情况下，淋巴结、血液和骨髓 中每一个淋巴细胞基因型是不一样的。如果来自某一分化阶段的单个淋巴细胞发生变 异，同时失去正常的免疫监视
12、，形成单克隆性增生，克隆性扩张的细胞基因型是一致的， 这就是淋巴瘤形成的遗传学基础，也是淋巴瘤分子病理学诊断的理论基础。当前对肿瘤 分子本质的共识：恶性肿瘤细胞克隆性增生。因此，检测肿瘤细胞的克隆性存在，即可判断恶性肿瘤。克隆性 重排检测临床上IgH和TCR基因单克隆检测在淋巴瘤的分子 诊断中普遍应用。作为淋巴细胞源性肿瘤的分子生物学标记，是淋巴瘤早期诊断和疗效 评价的基本方法。盲点：主要应用与淋巴细胞源性肿瘤的检测，其它应用尚少，存在假阳性。 11.大肠癌分子分型的临床意义A：分子医学视野下的结直肠癌：仁近端远端结肠癌 各有遗传通道，2远端结肠癌染色体5q,17q和18q等位基因缺失频率是近
13、端结肠癌的2 倍，3?近端结肠癌MSI频率是远端结肠癌的10倍，4?结肠癌两大家族：FAP和HNPCC, 前者好发于远端，与CIN有关；后者好发于近端，与MSI有关5?直肠癌基因突变多于结肠癌，6?上端，中下 端直肠癌预后不一。B：新发现导致了新的治疗模式的差异：女山表 皮生长因子受体（EGFR ）靶向治疗，K-RAS的靶向治疗。表皮生长因子受体（EGFR ）是原 癌基因C-erbB-1的表达产物，EGFR的过表达 / 突变在多种肿瘤的生长、发展及预后中起关键作用，包括结 直肠癌、头颈部鳞状细胞癌及非小细胞肺癌等。 物西妥昔单抗（爱必妥）已成为治疗转移性结直肠癌的一线用药。 态（野生型）或异常
14、状态（突变型），约有35%结直肠癌患者为K-ras突变 抗EGFR的靶向药 K-ras基因是细胞内 信号传导通路中重要的“开关”，从而影响肿瘤的生长和扩散。K-ras基因可以是正常状 型。K-ras 基因编码异常的蛋白，刺激促进恶性肿瘤细胞的生长和扩散，并且不受上游EGFR的信 号影响，所以对爱必妥治疗效果差。晩期结直肠癌肝转移患者的治疗显示，K?ras野生 型转移性结直肠癌患者一线接受西妥昔单抗+化疗治疗，客观有效率达59%,肿瘤进展 风险下降32%,疾病控制率在90%左右，患者中位生存时间达到25个月；而K-ras突 变型患者无论采用标准剂量还是剂量递增方案治疗均无效。进行K-ras基因检
15、测不仅可 以深入了解癌基因的情况，更重要的是筛选出针对抗EGFR靶向治疗药物有效的结直肠 癌患者，帮助医生选择对肿瘤病人最有效的治疗方法，从而真正实现肿瘤病人的个体化 治疗，还能大幅减少相关治疗费用和毒副作用。 12 现代肿瘤分子病理发病机制a 细胞癌基因在正常细胞中未激活，又称为原癌基 因。原癌基因由于结构发生改变，而被激活成为癌基因。原癌基因可发生结构改变（突 变）而变为癌基因；也可以是由于调节原癌基因表达的基因发生改变使原癌基因过度表达，进而导致细胞生长 刺激信号的过度或持续出现，使细胞发生转化。原癌基因的结构 改变包括点突变（如90%的胰腺癌有ras基因的点突变）、染色体易位（如伯基特
16、淋巴瘤的t（& 14）,慢性 粒细胞白血病的Phi染色体）、插入诱变、基因缺失和基因扩增（如 神经母细胞瘤的N-myc原癌基因可复制成多达几百个拷贝，在细胞遗传学上表现为染 色体出现双微小体和均染区）。癌基因编码的蛋白质（癌蛋白）与原癌基因的正常产物有质或量的不同。癌蛋 白调节其靶细胞的代谢、促使该细胞逐步转化，成为肿瘤细胞。 b.与原癌基因编码的蛋白质促进细胞生长相反，正常情况下细胞内的肿瘤抑制基因的产物能抑制细胞的生长。 若其功能丧失则可能促进细胞的肿瘤性转化。目前了解最多的两种肿瘤抑制基因是Rb基因和P53基因。它 们的产物都是以转录调节因子的方式控制细胞生长的核蛋白。肿瘤的发生可能是癌
17、基因的激活与肿瘤抑制基因 的失活共同作用的结果。c.恶性肿瘤的发生是一个长期的、多因素造成的分 阶段的过程，这已由流行 病学、遗传学和化学致癌的动物模式所证明。单个基因的改变不能造成细胞的完全恶性转化，而是需要多基 因的改变。癌基因以及肿瘤抑制基因的丧失或突变，这些阶段梯性积累起来的不同基因分子水平的改变，最终 导致肿瘤发生。 13. GIST 胃肠道间质肿瘤。胃肠道间质肿瘤已作为一种独立的肿瘤，以区别原诊断的平滑肌或神经源性肿瘤，多 数来源胃肠道CajalIHJ质细胞，命名为“胃肠道间质肿瘤， GIST”，GIST的发病机制关键在于C-kitg因功能获得性的突变 （gain-of-function mutation）LU及由此导致的 KIT 蛋白的异常活化。 S-100, LCAo根据上述标记的阳性与阴性表达，考虑癌，肉瘤，淋巴瘤，神经内分泌 肿瘤等。 15. 革巴向治疗指针对参与肿瘤发生发展过程的细胞信号转导和其他生物学途径的治疗 手段。比如抗CD20抗体美罗华，可以治疗淋巴瘤，抗EGFR的西妥昔单抗，可以治疗 转移性结直肠癌。 14. “套餐式”分型临床病理学常用“套餐式标记”选用: Ke rat 泊，Vimenti,