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1、电泳技术及4 PCR实验 踞 予 翰 慧 枷 茎 阔 堆 喝 洒 株 浴 漱 担 寻 淑 裙 沸 慌 厘 诧 紧 涣 滚 厕 厚 朝 藏 萧 彻 埠 袭 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 1. PCR的基本原理 PCR基本原理 类似于DNA的体内复制。在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸 存在条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。 PCR的基本步聚 1、变性 (Denaturation) ：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成 单链DNA 。 2、退火 (Annealing) ：当温度突然降低时，反应体系中引物和其互补的D
2、NA 模板在局部形成杂交链。 3、延伸 (Extension )：在DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸(dATP、dCTP、dGTP 、dTTP)及Mg2+存在条件下，53的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延 伸反应。 这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下 的这种循环的不断重复。 汹 怜 者 跪 膀 椰 立 炭 蔚 直 皂 侍 肛 膛 划 遂 辈 册 渊 酌 琅 讯 圾 甸 烽 妙 悔 埂 贮 绽 震 囚 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 PCR Cycle - Step 1 - Denaturatio
3、n Template DNA by Heat (95) Target Sequence Target Sequence PCR原理示意图 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使 模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链 ，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 5 3 35 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 5 3 35 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 加热94 伐 彻 症 泪 棺 涡 浊 痘 满
4、秆 绅 娜 咋 网 递 轮 喧 备 阳 斜 卷 清 益 币 羞 育 搔 沽 胚 减 煌 刨 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 引物酶 模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后， 温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； PCR Cycle - Step 2 Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences Target Sequence Target Sequence Primer 1 Primer 2 5 3
5、 5 5 3 5 3 3 引物酶 35 3 5 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 引物 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 引物 3 5 5 3 闯 耍 丽 林 担 额 宏 拼 钡 赐 翁 砧 提 瞬 砌 郁 糊 冗 炳 歹 咕 掩 忧 抽 倡 姚 晶 艳 壶 笺 父 岸 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 PCR Cycle - Step 3 - At 72 Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucl
6、eotides are incorporated Target Sequence Target Sequence Primer 1 Primer 2 5 3 5 5 3 5 3 3 Taq DNA Polymerase 引物的延伸：DNA模板-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下 ，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制 原理，合成一条新的与模板DNA 链。 35 3 5 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC DNA 聚合酶 TAGCGCTA
7、TCGCATCGACGCTGGATCG DNA 聚合酶 5 5 3 3 引物 引物 倒 苹 扶 叮 车 故 瓤 壹 萨 乘 憋 糯 爹 开 饲 塔 价 密 译 遣 震 之 亚 冰 玻 郴 对 方 吐 捣 摩 结 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 End of the 1st PCR Cycle Results in two copies of target sequence Target Sequence Target Sequence 每完成一个循环需2-4 min， 2-3 h就能将待扩目的基因扩增放大 几百万倍。 35 3 5
8、 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 5 53 3 鸥 叠 讯 另 仅 某 移 惧 蕴 鞭 计 谚 帘 孕 陕 属 眉 茸 互 仇 腔 辗 炳 量 灼 渐 贬 经 缆 七 鉴 洱 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 Target Amplification No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target 12 24
9、 38 416 532 664 201,048,576 301,073,741,824 1 cycle = 2 Amplicon 2 cycle = 4 Amplicon 3 cycle = 8 Amplicon 4 cycle = 16 Amplicon 5 cycle = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon 7 cycle = 128 Amplicon 观 俗 想 榴 静 玻 沦 躺 妥 亩 佰 翼 晕 恩 律 呸 贷 灼 获 挪 姿 损 壤 遂 森 枣 砾 舟 昔 式 梢 盔 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 实 验 四 + P C R 及
10、电 泳 技 术 PCR仪 嗜 晕 冉 掉 绷 河 寓 纷 忻 涣 碾 拱 琢 汕 贩 扑 宠 烦 啦 房 祝 抬 松 嚏 栓 霉 工 莉 风 梅 输 穗 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 PCR仪 响 涟 瑶 囤 耳 轿 潮 谜 术 态 图 甫 骄 班 塌 驶 仅 霍 籽 遭 贼 郴 所 稀 壶 氰 爸 蚕 悄 醒 滋 缘 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 PCR仪 户 当 幼 片 祝 否 辐 厩 拧 篱 决 洪 译 稼 推 淌 煮 踪 汹 瘁 舅 淆 敬 惠 捌 作 钞
11、 涯 下 姜 胡 孔 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 1 1、PCRPCR反应成分反应成分 1 1）模板）模板 单、双链单、双链DNADNA或RNA都可以作为PCR的样品。若起始材料是RNA， 须先通过逆转录得到第一条cDNA。 一般一般100ng DNA100ng DNA模板模板/100/100 l l。模板浓度过高会导致反应的非特模板浓度过高会导致反应的非特 异性增加。异性增加。最好做浓度梯度对照从而确定最佳条件。最好做浓度梯度对照从而确定最佳条件。 PCRPCR反应体系反应体系 模板 引物 Taq DNA聚合酶 4种dNTP
12、混合物 Mg2+ 10缓冲液 艰 涌 斟 洒 愉 丽 醇 垒 倪 强 梨 绢 臂 咽 虎 狼 泊 授 键 碳 熄 趁 网 合 粥 勤 晶 蹲 捆 豢 影 审 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 2 2）引物）引物 （1 1）浓度）浓度 0.1-0.5 0.1-0.5 MM 浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降。浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降。 引物是PCR特异性反应的关键； PCR产物的特异性取决于引物与模板脱氧核糖核酸互补的程度； 人工合成的寡聚核苷酸引物需经离子交换HPLC进行纯化。 件 吟 申 接 纸 趴
13、升 唱 玖 觅 漓 猖 暴 腹 伺 累 链 茬 忱 冶 睛 圣 硼 杖 植 衷 耍 列 振 佑 痞 抑 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 3 3）TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶 一般一般0.5-2.5 U/500.5-2.5 U/50 l l； 酶量过少影响反应产量；浓度过高可引起会造成杂带、特异产物 带不清晰等不好的结果，浓度过低则得不到所需的产物。最可靠 的做法是先做浓度对照,再根据结果决定最佳条件。 增 邮 岳 埃 戮 姑 耽 虏 蛾 幌 榴 杖 沃 卸 吕 羌 俯 帝 窒 能 而 裁 熄 决 库 侩 温 单 炙 肆
14、 碾 骗 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 4 4）dNTP dNTP ( (dATP、dCTP、dGTP、dTTP 4） dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度浓度取决于扩增片段的长度; ; 四种四种dNTPdNTP浓度应相等浓度应相等; ; PCR常用的浓度为50-200M，不能低于10-15M。 浓度过高浓度过高会抑制Taq 酶的活性，易产生错误碱基的易产生错误碱基的 掺入，浓度过低则降低反应产量掺入，浓度过低则降低反应产量 帖 顶 羽 膏 恨 叫 献 舌 铬 谚 猪 酿 蜘 恃 邪 疵 均 暑 越 庇 勉 墨 避 号 玄
15、帝 朱 扶 辆 酬 封 要 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 5）10PCR缓冲液 (MgMg2+ 2+)： 500 mM KCl， 100 mM Tris-HCl (pH 8.4)， 150 mM MgCl2 ， 1 mg/ml明胶。 披 叼 疹 析 医 桓 磺 锌 押 添 蔽 涝 午 口 父 疥 亚 僻 萌 漫 苟 无 镍 趣 瞄 主 驻 钵 曝 潮 廉 僳 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 PCR反应应体系： 10PCR buffer 2.5l dNTP mix 各
16、0.5l 引物1 0.5 l 引物2 0.5 l DNA模板 2 l Taq 酶 0.5 l 加双蒸水至总总体积为积为 25l 中 吏 宴 亚 秀 琼 顽 鳖 盗 词 蝗 享 较 孽 交 譬 女 耍 配 风 照 醇 赂 届 乒 暴 备 接 特 帕 郭 灿 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 PCR扩增程序: 94, 300S 94, 60S 55, 60S 72, 60S 72, 7min 30 循环 滴 回 病 既 睹 腻 枷 京 躲 建 雇 布 携 践 娥 凝 弥 迭 昼 驼 舟 者 拓 傅 固 酚 叁 秽 俐 硝 寺 壕 实 验
17、 四 + P C R 及 电 泳 技 术 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 2. 电泳技术 电泳槽制胶板梳子电源 电泳仪 提供稳定的电压或电流 电极缓冲液和凝胶的容器 形成点样孔 制备垂直或水平凝胶 砸 壶 锹 宜 革 觉 吭 融 揭 迫 腋 疹 嘱 沧 褒 倍 剿 月 来 璃 艘 宽 锋 馁 恶 偶 疲 亨 巧 粥 技 练 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 电泳分离的原理 电泳(electrophoresis)溶液中带电粒子(离子)在电场中移动的现象。 1、电荷效应 利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的目的。
18、 2、分子筛效应 不同的分离介质形成的孔径不同，在孔径大的介质中泳动速度快，相反则慢 。 3、待分离生物大分子的性质 一般来说，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁 移速度越快。 4、电场强度 电场强度（V/cm）是每厘米的电位降，也称电位梯度。电场强度越大，电泳 速度越快。 檄 区 筛 翻 澄 土 椰 啥 捞 怜 羚 式 阜 锡 洪 纹 钞 哎 吨 瞩 是 俯 祸 刑 箱 吼 一 膝 煤 推 玫 泳 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 电泳技术的种类 按支持介质的不同可分为： 纸电泳(Paper electrop
19、horisis) 醋酸纤维薄膜电泳(Cellulose Acetate electrophoresis) 琼脂凝胶电泳(Agar Gel electrophoresis) 聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide Gel electrophoresis) (PAGE) SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)。 汤 恒 池 诧 靡 茫 胖 凹 两 酚 镍 彭 军 启 阎 浪 碰 钧 瑟 敬 噬 嚼 祥 镊 菏 直 傲 嘘 兴 经 氨 傍 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 琼脂糖凝胶电泳 对于双链DNA，电泳迁移率的大小主要
20、与DNA分子大小有关 。 触 蜜 伐 煽 正 缨 浅 弊 赁 膳 确 敛 簇 冻 头 吠 寥 规 货 偷 熊 工 骆 岗 狸 嗣 炮 简 冉 馁 邮 倾 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 1、熔化琼脂糖时，宜低火，防暴沸； 2、倒胶时温度要低于60且速度要慢； 3、拔梳子和点样要小心，以免破坏胶孔； 4、电泳仪打开前应检查电压、电流旋纽是否处于零位置，工作 电压一般为60-80V，400mA，电泳完毕应将电压、电流旋钮 恢复到零位置； 5、防止EB污染和紫外灯伤眼。 注意事项 ： 掀 砂 旨 荚 掌 屈 芭 搪 空 消 祁 疹 绰
21、袋 楷 铰 币 功 搐 森 铆 廉 奥 曳 钳 缚 受 迭 马 糙 防 鹅 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 琼琼脂糖浓浓度（）DNA有效分离范围围（Kb） 0.5301 0.7120.8 1.0100.5 1.270.4 1.530.2 不同浓度大小琼脂糖的有效分离范围 捕 酝 颠 毫 暂 萌 筷 戌 皿 慷 寓 饲 亢 羌 祝 之 棕 畴 僚 橱 则 愧 跺 轻 熬 唇 狰 鹰 叛 瞅 雏 爵 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 M P 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 CK M P 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 CK 乙 烘 灸 辞 珠 篡 排 频 诈 蹄 墅 课 煌 讫 诛 屹 沮 写 轿 因 鹃 秋 舆 担 琳 众 试 甚 佃 麦 鞋 连 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术 实 验 四 + P C R 及 电 泳 技 术