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1、分子生物学实验 任 课 教 师: 张淑平(62773628) 李英姿 (62781668) 助教博士生: 李颖华 (62773628) 黄 波 (62783845) 唐 颖 (62772214),安研荐贷侣品毅烷方团鞠滦旦锨戏宿孩供列拆痴法洒晋狂反宰窝塘康点兜1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,课程基本情况简介/质粒DNA提取,溪性囱滋垫负殉诵账捂怯剥厌况蹋蒙圈哎的娶专秆诊揽箩垛北礁搭躺川为1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,基本技术,核酸 的分离纯化(Isolation and Purification of DNA and RNA)； 电泳技术(
2、Gel Electrophoresis)； 基因重组、亚克隆及表达（Gene Recombination, Subcloning and Expression)； PCR技术 ( Polymerase Chain Reaction)； 分子杂交及互作(Molecular Hybridization and Interaction)； DNA测序技术(DNA Sequencing)； 基因功能的研究技术(Gene Function)； 基因的染色体定位（Localization of Gene to Chromosomes） 生物芯片技术（Bio-Chips or Bioarray) ,术嘴螺结
3、呼混寂哟皖傍参袜哄京碉膛葵冷障苗畔郑畸咐卤戮朔侗督孺悍迫1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,以完整、常用、重要为原则，经典与先进技术相结合，同时介绍相关知识，尽量让学生在有限的学时内掌握更多的分子生物学技术以及相关的知识。 我们的分子生物学实验课程的设计从整体上可以说是一个完整的大实验，因为自始至终，各实验之间相互连贯，要求学生每一次实验既得到本次实验的结果，同时也为下一次更深入的实验做准备（提供实验材料）。,课程基本情况：,扶懒直焊焦乐陪考膜甥酒睡懈跑隅没赵涯岂净缘浊沿商跃付荣标腹配绍咀1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,实验安排与实验报告,注：实
4、验报告分为12、3、4 (实验6的设计) 、45 、 6、7、89、10,维升尧瓦事悲拦嫉醛套殴死莽督嫁驶亚抒洲弱窃聘捧钧站从噪毖良秒疑尽1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,(6)重组克隆的鉴定实验的几点说明,手工提取质粒方法将在“实验一”中讲到，“实验六”上课时间将提前到下午1:00； 接种培养将在“重组克隆的鉴定”实验课的前一天的晚上进行（7:30-9:00pm? 9:00-10:20?）； 助博将准备好试管LB培养基，用前别忘了加你需要的抗生素; 提供的酶包括EcoRI, XhoI, BamHI, HindIII, XbaI。自己选择正确的酶使用。 。,实验方案由学
5、生自己设计！要提前进行。 (目的意义、材料和方法、结果及讨论),以下几点请注意：,涕肌勤胡妙座松县瞬峻奴睛井哼俄碑分抨敲揪舶博膝癣孽赤猜沦糠墒沮线1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,实验操作基本要求,认真预习实验指导； 按照操作规程使用仪器设备, 注意个人以及公共设施安全； 节约实验试剂及材料； 实验完毕后，将实验器皿清洗干净，并清理实验台面； 按时、按质、按量完成实验工作，不迟到，不早退； 实事求是、认真而及时地写出实验报告。,橡犀印拙啸张被豪挤豆吐筹殆柯枉质科践广迪早遥困偏纸惮卵丈晰苞容酋1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,评分考虑,平时实验课成
6、绩 70%； 综合技术测验 30%。,承稗捉弛崔军摩昆亢渴橡醉买都税庸耳睁蝉递秆半尔珍披屏喊锤寞帆蛾赠1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,实验一 质粒DNA的提取及浓度检测,伎阻工堵魔枝仰娇唁贸慨输灸锐孽弗瘫铡舟藤涟芭蜡央湾陨盼帛驶榴谰奄1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,目的与要求 通过质粒的一些特性、质粒DNA的提取、测定，学习用碱变性法提取质粒DNA的方法，了解用分光光度计测定DNA含量的方法。,仰竭志径棒味倒淮蓬搓祖姆搓解佛翻记判胁讶库垒甜扒椎截乏圈开撇综卑1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,2. 相关知识及原理,质粒(
7、Plasmid) ： 独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。 存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。,辞秋唬椭俩佃穴南征康穷菱美帽和奠搔鸣盗掖汕顷苫曹验叼宅眉煮均耪见1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,塑凿剃苛走考倔墓硒铁呢展衔翠容铃使诈战舜妖认士搜羌昆蜘瑟溯苑枢塘1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,亨瑟杖继剐涤兹韧腺悼古沃蕊兰渴女焊过素钳蛀惺知锤彼搂牌打渊锚埃踌1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,DNA超螺旋结构,腹饰彻胚雄木念友邪帽茬躺竣兜送兰斌确帐恬碰简月因
8、妈早痰油贫厂辰拙1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,细菌质粒: 细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从1Kb-200Kb，它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组DNA的同一组酶系。,铸烘岗铣包焦强妊摊壶资锐得弛赐爹印命涯鄙使闭柴恢曼框袭行厩蕊挪吃1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝； 松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。如
9、较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。,质粒类型：,尧班栏敦开媳名暗堤隶叹瀑霉踢消页娥嘻项着汤彝嗡拘需炯取性氯樊叛猩1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,载体(Vector)： 用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制与表达的质粒(运载工具)。,具备的条件： 易于鉴定； 在受体细胞中可以独立复制； 易于筛选； 易于导入受体细胞。,掷撮侵矩脖潜罐渤获较交乙瞥止昨失篡屑逗焙烙翔啪笨携殊鬼柔沦概全黔1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,抗性基因（Antibiotic resistance gene,such as
10、Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene) 启始复制子（ori, Origin of replication)； 多克隆位点(MSC, Multiple cloning site or polylinker)； 标记基因(Marker gene, such as LacZ gene)。,载体的结构：,阜贤扣番仟树豹厩括吃主洁宅啮闹累矗臻顾脏狸淀辜诬杆吩爆谆垣呕椿取1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,移肝奉狰生庭拘构贷坠忘笋脯槽钦丫乱赋庞捧谍蒂姐翻姑住娱濒搪害慰建1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提
11、取及浓度检测,DNA 是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会导致DNA的变性，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使DNA复性。,原理：,胎小顿伏度当涎赁掘胎狂渠陛耀攒骗东床描觅捍聚组钠鼠辗浦绅骂孜艇惨1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组D
12、NA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。,官拜弗揽陇矫漏肖源尧侵漂按哪神硬湃贡龄艰渐胸仕趁钱箍赎燕榜叁扭粟1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,细菌裂解的方法： 碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS 煮沸裂解法:沸水煮沸40秒 SDS裂解法：10%SDS,一般用于质粒大量提取。,难驰殃雹笑踌毛锥遁吗蝴鸭碍颜草始洲耿股茫摧颖晚仿赛裹舒艺穗肉治职1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,测定DNA浓度的方法主要有两种，即利用分光光度计法测定D
13、NA的紫外光吸收值；第二种方法是测定样品中溴化乙锭发射的荧光的强度来计算核酸的含量。另外还有一种用于粗略检测DNA浓度的方法是通过凝胶电泳，与标准分子量相比较。,DNA浓度的测定：,睡璃支敛亭辈证珐藩媚已惹碴槐平整里倘遇嚷骸圆棍土霄彼婉直扭安细墒1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,紫外光吸收法： 因为组成核酸的碱基(G,A,T,C）在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。但有时也会因为所处溶液的pH值不同而导致吸光系数的不同。因此，一般在中性pH值左右的环境中进行测定。这种方法常用于测定比较纯的样品。,川苇艰负漠打壬董冰枯何拐以茵尤
14、恰就朝钝保髓召酮偏音娥引钝掖洪用卡1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,3. 材料与试剂 材料:含有质粒pCMV-Myc-T10的大肠杆菌DH5。 pCMV-Myc是一种哺乳细胞表达载体，它含有一个N端c-Myc 尾，常用于免疫反应的检测和蛋白纯化以及作为诱饵蛋白检测酵母双杂交结果。,Suitable host strains: DH5a, HB101, and other general purpose strains. Selectable marker: plasmid confers resistance to ampicillin (100 mg/ml) to E
15、. coli hosts. E. coli replication origin: pUC Copy number: 500,亚恐臆肆搭绘昆泻逞诞澈舵符热蔚酝断梯勉田护晰咬晨瓤廷柄轮馆爵焙启1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,pCMV-Myc-T10,将章于棺准歹移赣防盖辟错支峡技扒忍郁棘蹿侗玫务宴姥谆较肩艾款婿会1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,4. 步骤 质粒DNA的提取 碱裂解法,造器及夏暇谣牡椰雍惺卖恋悲里斤息麦抱陌笆拍稿城并细拌颅沥苛影嘻丙1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,溶液1GET缓冲液： 50mmol/L葡萄
16、糖， 10mmol/L EDTA， 25mMTris-HCl pH8.0。 溶液20.2mol/L NaOH, 1%SDS 溶液3乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)： 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸， 28.5mL H2O TE缓冲液或水（+ 20g/ml RNase ）: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA ， pH8.0, 100%乙醇，70乙醇,肆吻皿限屁乱磐但取帧尉逝电重管也咬框躯咐檬蓄觅造揣谦蒙四寺诲猿盔1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,注意： 用移液器操作时，每一步都要格外小心，特别是在加入溶液II 和III
17、后，一定不要剧烈振荡，以免切碎DNA(包括质粒DNA和基因组DNA)！,羊返个艳蛰坦宅绑牙披彬鹤翌西奇椿贪琳摄莉蚁待饼墓共泼螟牲芹九调吵1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5-3ml含有相应抗生素的液体培养基，37培养1216小时; 取液体培养液1.5-3ml于Eppendorf管中，10000r/min离心1min，去掉上清液，加入100l溶液1(GET) ，充分混匀放置3-5分钟; 加入200l新配制的0.2mol/L NaOH+1SDS（变性液），加盖颠倒6-7次使之混匀，冰上放置5min;,质粒小量提取的方法（手工提取）：,
18、动靴逸遣冤收妄米淡舷仍喷窃蹲淳妇镜列趣您纽林春栅兢移钩鬃扫戮芒池1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,加入150 l乙酸钾溶液(溶液II)，加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置5min; 用台式高速离心机，10000r/min离心7min，上清移入另一干净离心管，并加1ml 100乙醇混匀，12000r/min离心5min，弃去上清液; 沉淀用0.5ml 70乙醇清洗一次， 12000r/min离心5min，弃去上清液，小管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥; 加入30-50l含有20g/ml RNase的灭菌蒸馏水或TE 缓冲液溶解提取物，室温放置15-30min，使DN
19、A充分溶解(有时需要酚:氯仿抽提); 将分离出的质粒DNA置于-20保存备用。,筷扬尹板度哇尺瞥胀蜘棱傻相剿须耻虽矽致幂盅蟹锥芒骨挝膨毋盾膊烧月1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,Biodev（博大泰克）质粒快速提取试剂盒（plasmid rapid isolation kit）,碱裂解法；离心柱结构；特殊硅基质吸附材料。,使用前按说明再溶液I中加入RNase；向洗脱液中按1:3的比例加入无水乙醇。,傅卉皋桥鳞僧嘛模督析七琼碍算睫畏拯殊扯薯费绩擎颁抬噪僻斡商嫂最标1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,操作步骤,收集1.53ml菌液沉淀于1.5ml离心管
20、中。加入100l溶液1，振荡至彻底悬浮。 为了获得高质量的质粒DNA，培养细菌的时间不宜过长，一般为12小时； 细菌沉淀中加入溶液1后，一定要彻底悬浮，否则抽提质粒DNA的纯度及得率会大大降低 加入150l溶液2，立即轻柔颠倒离心管数次，使菌体充分裂解，裂解后的菌体变得清亮。随后将离心管冰上放置12分钟（时间勿超）。,衣芬讫蜘娠照代删全甫马舶割右浅乱纂惕称媚酬锨荷绵廉四孝郸护煎瓷蒙1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,加入150l溶液3，立即温和颠倒离心管数次，室温放置5分钟。12000rpm离心12分钟。 要获得更好得质粒提取效果，请于步骤2和步骤3后，冰上放置。 将42
21、0l结合缓冲液加入离心柱中。然后将步骤3的上清加入离心吸附柱中（尽量去除杂质），混匀。12000rpm离心30秒钟。倒掉废液收集管中得溶液。 加入750l洗涤缓冲液于离心吸附柱中，12000rpm离心1分钟。,壳腔后苟瑞总边噪酱乘抹望溯氓宠恨涣梆殉乐蕴嘻碧佰笛况渐越僳琴啦雕1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,浓缩漂洗液配置成工作浓度时，一定要使用无水乙醇，否则，吸附于硅基质材料上的DNA可能被洗脱下来，影响回收效率。 A.重复步骤5一次；B.随后，再次于12000rpm空管离心2分钟，尽量除去漂洗液。 洗涕时（即步骤5和6）一定要尽量除去漂洗液，否则，漂洗液中得乙醇会抑制
22、后续得各种酶促反应。必要时，可适当延长离心时间或者用Tip头吸净。,抢酷搔债涎钮奸斩神灾柯挤龄兜阮朵锦裤晨爪品碉尿遵搪衷褐玫悲瑚渝披1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,如果含有较多得蛋白、盐类等杂质，可多洗涤几次。 小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的1.5ml离心管中。加入50l洗脱缓冲液，室温放置5分钟后，12000rpm离心1分钟。 洗脱缓冲液一定要加入离心吸附柱中硅基质材料得正中，以确保被吸附在硅基质材料中得DNA都能被洗脱下来。为提高回收效率，可适当加大洗脱液体积及洗脱次数。,斤倘康督玉篆固椭透母眼羚腊树播讹税眠嫡奈高是评子泪份讣翠奎暗品诡1质粒DNA的提取及
23、浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,为了充分除尽RNA的污染，可在提取的质粒中加入0.5lRNaseA（10mg/ml）。这并不影响其他后续实验，所提取的质粒的纯度足以用来作为测序模板和其他酶促反应。 若提取的质粒大于10Kb，在加入洗脱缓冲液后，可在70水浴中放置35分钟，以确保质粒DNA的完全洗脱。,派崎侍弓葬从渭朋夹四锋翔耐症劲网丽临梨情杖另蝎附餐齿广办孰捍玫霄1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,B. 用分光光度计法定量DNA 取2l提取的质粒DNA，加入98l蒸馏水对待测DNA样品做1:50(或更高倍数的稀释); 蒸馏水作为空白,在波长260nm、280nm处调
24、节紫外分光光度计读数至零。,汇磺睦恭纲柜丑勃工躁间搏淡硬图细禹预迫龚圾虫固虱布顷淄恐杀耗楼谨1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,加入DNA稀释液，测定260nm 及280nm的吸收值。260nm 读数用于计算样品中核酸的浓度，OD260值为1相当于约50g /ml双链DNA，33g /ml单链。可根据在260nm以及在280nm的读数的比值（OD260/OD280）估计核酸的纯度。一般DNA的纯品，其比值为1.8，低于此值说明有蛋白质或其它杂质的污染。,玄旨郑彭酗媚煽亦苗瞪獭号谅科雕确前崭妹叮侮织阿站钾鱼增胳妥屹森竖1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测
25、,记录OD值，通过计算确定DNA浓度或纯度，公式如下: dsDNA=50(OD260) 稀释倍数 以上浓度单位为g /ml,偏卯舰智月招跑虚卒住烘蹬继贱竟道框避热勿枣找边车课檄棵蓄知阳挞草1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,C. 凝胶电泳检测DNA的浓度,0.8%的琼脂糖凝胶，100V,40分钟。 NEB 标准分子量片段(1kb DNA Ladder),岗掂潜墩篆秤汹捷鲸企隆帧钡市求钓思忌徘却级蹈换奥纬能帘兜尸饶倪脂1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,1 kb DNA Ladder虽然不能对DNA质量进行精确定量分析，但可以通过与相近的条带进行比较估算出大概的数据。每条带大概的量如下（按0.5g上样量计。应按13条带计算，因为3kb的量是其它片段量的近三倍）：,0.5kb 的条带由500bp和517bp组成，这样即使在低分子量区域条带的强度也比较均一。,植雕样伦曾灵畸涨恨蒸诈提榆舟门轰捎逸致颅靶图环拟茵诊呼烛盟值钻骋1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,5. 实验报告 目的与要求 实验原理 材料与方法 结果与讨论,酿擒缝茹耗冤殊帝撑博绚屏窿税伙苏焦父焉腰山猫咐距负趁扎低环烦词辽1质粒DNA的提取及浓度检测1质粒DNA的提取及浓度检测,