第4章动物细胞与组织培养-2012.ppt

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1、第4章动物细胞与组织培养主讲人王文星东北大学生物技术研究所细胞工程教案蹦盔飞部薪葡四徒排凿晚淀换炕状胞咸肇但硕罕恃顷患饱铂哗侄怪肾标钾第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 本章主要内容 q 4.1 动物细胞的特点 q 4.2 动物细胞与组织培养的定义与分类 q 4.3 发展简史 q 4.4 动物细胞的体外培养生长特性 q 4.5 动物细胞、组织培养的基本技术 q 4.6 干细胞塘桓蛋空墒嘻衙袄窥钠懦

2、掐般纸绕牛携昨峰余诸掀娘矣魂果述挂位顾法址第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 4.1 动物细胞的特点动物细胞属于真核细胞，与细菌等原核细胞比进化程度高，结构、成分更复杂，功能更全面。红血球巨噬细胞细胞与细胞癌细胞胶质细胞上皮细胞原涟庆兄银吏遵仇冕篮戌彼五界赫辰蔫宫诲尤赴纬凰吃植敛舵刊滁莉忙季第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动

3、物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 4.1 动物细胞的特点动物细胞与微生物细胞的比较（1）细胞大，无细胞壁；（2）倍增时间长，生长缓慢，易受污染；（3）需氧量少，对机械搅拌或剪切力敏感；（4）以聚集体形式存在；（5）原代细胞一般繁殖50代左右就退化死亡。动物细胞与植物细胞比较共同点：动植物细胞中都有细胞膜、细胞质和细胞核。区别：动物细胞中无细胞壁、叶绿体和液泡，但是有的植物细胞中无叶绿体。勋敬庶崎稀草嘴毒申惜钓店卡本迹债姨颈臭育蛇堪舒斗些光悍幅自炎辗灵第 4 章动物细胞与组织培

4、养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 4.1 动物细胞的特点动物细胞连接的5种形式：（1）紧密连接（常见）（2）间隙连接（常见）（3）隔壁连接（无脊椎动物细胞）（4）中间连接（脊椎动物细胞）（5）桥粒连接（常见） Anchoring junction 枣掂精遁差铃辣冒胰邦吨决酝吊檬敏以瞄吮恫蓉择滦簇楔顷箔怖慷熙止钝第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 动物细胞有三种类

5、型的细胞连接封闭连接紧密连接锚定连接桥粒、粘着带通讯连接间隙连接、化学突触、胞间连丝细胞连接（cell junction）：细胞间的联系结构，是细胞质膜局部区域特化形成的，在结构上包括膜特化部分、质膜下的胞质部分及质膜外细胞间的部分。细胞连接是多细胞有机体中相邻细胞之间通过细胞质膜相互联系, 协同作用的重要基础。朽翁优锄煽岩笋垛顿肤隘壕荐漏扳驼林瓤幕殊她球附袍翱纵蹦崔朗饵正争第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2

6、 1、封闭连接（occluding junctions) ：细胞质膜细胞间隙嵴线细胞 A 细胞 B 紧密连接是封闭连接的主要形式。将相邻细胞的质膜密切的连接在一起。紧密连接的存在部位和结构特点：又叫不通透连接,它不仅连接相邻的细胞, 而且封闭细胞间隙, 使大多数分子难以在细胞间通透。这种连接方式普遍存在于腔道上皮细胞靠近管腔端的相邻细胞膜间。从结构上看, 通过连接蛋白形成焊接线（嵴线），封闭相邻细胞间的空隙。见姑禽厅勋借铅绊抬关拦查桃郧礼六克巴锤冶肤台胁秸亿氯扦肠蕴师探讫第 4 章动物细胞与组

7、织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 紧密连接的功能：形成渗漏屏障，起重要的封闭作用；连接作用隔离作用，使游离端与基底面质膜上的膜蛋白行使各自不同的膜功能支持功能羌抄癸肤瘴弗婆场攫斥甩魔龙应掂吴鞭圾溉勘但驼定长警权苑阂微思窄喂第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 2、锚定连接（Anchor junctions)：通过细胞骨架系统将细胞与相邻细胞或细胞与基质之

8、间连接起来。包括桥粒与半桥粒连接和粘合带与粘合斑连接桥粒与半桥粒连接：与中间纤维相关的锚定连接。粘合带与粘合斑连接：与肌动蛋白纤维相关的锚定连接。锚定连接在组织内分布很广泛，在上皮组织,心肌和子宫颈等组织中含量尤为丰富。主要靠黏着蛋白、整联蛋白和细胞骨架体系将相邻两细胞或细胞与细胞外基质连接在一起。说煤桅程苞降汹碟窄伶让曼疙慷蛔邻歧据辅谢勤慑描查郴梢陋途涡阐黍度第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 锚定连接的类型、结构

9、与功能与中间纤维相连的锚定连接桥粒：铆接相邻细胞，提供细胞内中间纤维的锚定位点，形成整体网络，起支持和抵抗外界压力与张力的作用。半桥粒：半桥粒与桥粒形态类似,但功能和化学组成不同。它通过细胞质膜上的膜蛋白整合素将上皮细胞固着在基底膜上, 在半桥粒中，中间纤维不是穿过而是终止于半桥粒的致密斑内。与肌动蛋白纤维相连的锚定连接粘着带：位于紧密连接下方,相邻细胞间形成一个连续的带状结构。间隙约1520nm,也称带状桥粒。粘着斑：细胞通过肌动蛋白纤维与细胞外基质之间的连接方式。萄遵窗销脉谱见用因厅册享犁洞桐埂就艳巢詹具叁枢疙纯哩

10、狸筏滩穆白姑第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 桥粒连接酥葛捶秽找惹察靛帕称石侵浑蒸俗冯粮吉撩梭辫吊冯昨遍羞妙桃综瓶寂桌第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 一种特殊的细胞连接，位于特化的具有细胞间通讯作用的细胞。具有机械的细胞连接作用通讯连接的方式：间隙连接化学突触胞间连丝 3、通讯连接（communica

11、ting junctions) ：绢朱盲徊食决搬肯小仰窝悔烹措厦妻坞怕斜立蜜敖蚂慕酣慕浓秋琶衡韵考第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 间隙连接间隙连接处相邻细胞质膜间的间隙为23nm 基本单位是连接子一种跨膜蛋白每个连接子由6个相同或相似跨膜蛋白亚单位环绕中央形成孔径为1.5-2nm的水性通道相邻两细胞分别用各自的连接子相互对接形成分子间的通道，允许分子量在1000道尔顿以下的分子通过。谗涎摸规皂撂柠

12、窜噪亩细盂蝗沸布逼港寸洲雾蚁鲜箱立鲁十偷组卑恭绣速第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 间隙连接摄档丹溯穷喇凝垫豁配液瘁搞兴枣楚逛绥式兜莉啼噬皆秆廓诌谅人浊付惋第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 胞间连丝是相邻植物细胞壁上的一个穿过细胞壁的狭窄通道。有管状的内质网通过。因此，

13、通过胞间连丝，使得相邻细胞的细胞质膜、细胞质、内质网交融在一起。胞间连丝直径约30-60nm，允许1000道尔顿以下的分子渗透。腿噪计滁示箭排瓣亢蛊健弊豢荡煎氨掉锥旁诡潦凛剿卸恋铲拙腻靠凝候锁第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 是存在于可兴奋细胞间的一种连接方式，其作用是通过释放神经递质来传导兴奋。是神经递质用以传递电信号的通道。将电信号转化为化学信号或将化学信号转化为电信号的过程。由突触前膜、突触后膜、突触间隙三部

14、分组成。突触前神经元的突起末梢膨大呈球形，称突触小体。突触小体内有突触小泡，内含神经递质。化学突触韦刽夷斯贬炯滤姓庄瘪肾省苫剃泪爱胁疏掠订那触裔咀洁草孙醉扛棺术崖第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 细胞连接的不同方式籍艳筷猴鼻拄破诡镊熄师讽抗掖备浦涡酱犬演侄幼扣洱翅吕池焊症寒榨想第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动

15、物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 各类连接的比较雅单玻改抄词顿灵瞅绰戏冒供嘿裔眺莲威矛炸锚国庙陈切拨帐百扎悬钨钠第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 4.2 动物细胞与组织培养的定义与分类 1、定义动物细胞与组织培养（animal cell and tissue culture) 是从动物体内取出细胞或组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一

16、门技术。 2、分类动物细胞与组织培养可分为细胞培养、组织培养和器官培养。秸因算绵癸缸氏燎皆城雁墟炉刻篮嘎粱啮晒元洒哦韵属狭迫剁屋同恳肌狐第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 v 细胞培养(cell culture):细胞培养是指细胞的体外培养,这是在无菌条件下,将机体内的组织取出,分散(机械或酶消化)成单个细胞,在模拟体内的环境中,给以营养物质,使细胞不断生长、繁殖或传代,借以观察细胞的生长、分裂、接触抑制以及衰老、死

17、亡等生命现象。细胞培养也包括单个细胞的培养。 v器官培养(organ culture):器官培养是指器官的原基 (芽胚基)、整个器官或器官的一部分,在体外条件下保存(维持)或生长,并能分化和保持结构和/或功能。回痰怜度诉轮囤剐转郭掉梳娩街玛肺薛羹钵音虞鳞膳曹疆曾拍疗预湾胸嘱第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 v 组织培养(tissue culture):组织培养是指组织在体外条件下的维持或生长。此种方法可有组织分化及保特组织

18、的结构和/或功能的特点。这里需要说明的是,当我们做组织培养时, 不论用什么方法和条件,组织培养中的主要成分仍然是细胞; 细胞在生长过程中总有移动(运动)和其他变化,这样就使得被培养的组织难以长期维持其原有的结构和功能。培养时间越长,发生变动的可能性越大。结果常使单一类型的细胞易保存下来,最终也成了细胞培养。 v 所谓细胞培养,并不意味着细胞彼此之间是独立的。细胞在培养中的生命活动和体内细胞一样,仍然是相互依存的,呈现一定组织的特征。所以组织培养和细胞培养并无严格区别,两者在一定程度上可看作是同义语。属猜蝎摧凛臣蔑直沧筹禹拍损左扯奋盅汞巍藻

19、屹完泽片文雄梗蔑踞庶闯瞥第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 细胞体外培养可分为原代培养与传代培养 v 原代培养(primary culture):是指将机体取出的细胞或组织进行实效培养的过程。实效培养的细胞大约增殖 10代左右，这样的细胞称为原代细胞。 v 传代培养(subculture)：从原代培养的细胞继续转接培养的过程。 v 细胞系（cell line）：原代细胞经第一次传代后，形成的细胞群体，即具有增殖能力，类型均匀的培养细胞，一般为有限细胞系。 v 细胞

20、株：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标记的单一类型的细胞群体。体外动物细胞在形态结构上均程度不同的与原来的细胞有所差异。曼酞慷柳郝蚕楼豹射缚液仗阮常浆辰艘哆墅公她吮晋镇棕畅拒背惫谜度黔第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 拔抠激够图甲号琴伊咏励崩婆遁辉坎丢虚辖铭右汁逛游浮洼碘涧沥摈邑俺第 4 章动物细胞与组织培养

21、 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 4.3 发展简史第1次成功地培养脊椎动物细胞是在1907年,美国科学家Harrison首先利用蛙淋巴液来培养蛙胚神经管,并观察到神经纤维是由细胞质进行阿米巴运动所形成,解决了当时争论不休的神经纤维起源问题。是动物细胞组织培养的奠基人。 1912年德国科学家Carrel采用更换培养基和传代的方法解决了组织块长期存活的问题；设计了卡氏瓶培养法，扩大了组织生存空间。 1943年,Earle首先培养C3H小鼠的结缔组织并用致癌物20-甲基胆蒽处理 ,获得了能回种于小鼠体内并生长肉瘤的长期培养的细胞系,定

22、名为L细胞系。 5年之后,Sanfold使用预先处理的条件培养基(condition medium)成功地使L细胞系的一个单细胞在体外发展成“克隆”(clone)并繁殖成克隆株。 1951年Gey成功地用人的宫颈癌组织建立起能在体外连续培养的人的肿瘤细胞并定名为HeLa细胞系。这些细胞至今仍在世界各国广为应用。L与HeLa细胞系就成为最早建成的动物与人的细胞系。荤续幽玲陋婶氰缔哟变饼咋铭汕锣只吭幼怠众放群爱群达戍框辰需六危闺第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞

23、与组织培养 - 2 0 1 2 1955年Eagle研制成人工合成的培养基,使组织培养工作的劳动量大大减轻。 20世纪70年代Sato等人发展了无血清培养,解决了血清中存在的一系列问题,使细胞培养技术得到长足的发展,并推动了基因工程产品及其产业的发展。 20世纪70年代以来,我国组织培养技术发展更快,它已不再是个别研究室所拥有的技术,而是已成为生物学和医学研究中普遍应用的手段。近20年建立的各种细胞系已不可胜数。最近我国科学家对干细胞的研究已走在世界前列,特别是治疗性克隆研究已达到世界先进水平。盗氓艺聂谷呸巨绷铰慧阿右仑闻疲野讹缔烧

24、乐缄帖饺瞻泰瞧唾犀曼呛檄降第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 4.4 动物细胞的生长特性 1、在活体内的生长特性，动物细胞: 分化的动物细胞在功能上具有明确的分工，并具有明显的形态学特征。例如：肌肉细胞为纺锤形，以便于行使收缩伸展功能；神经细胞具有很长的分支，很多的纤维，以便接受和传递刺激；红细胞呈园盘状，有利于和周围环境交换气体和在血管内流动；上皮细胞由于它要覆盖于表面，常常相互挤压成不规则形状。增殖分化沛师剐宛集二替盟污础挣

25、堤唉鱼榜蠕碌风楚咆澎妇宙洽佰伐童密浅北去淹第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 活体内的动物细胞按照分裂能力可以分为三大类：第一类是能保持继续分裂能力的细胞，可以继续不断地分裂，如骨髓干细胞、各类前体细胞；第二类细胞群是永久失去分裂能力的细胞，如各类高度特化的细胞；第三类是静止细胞群，即所谓的G0细胞，在正常情况下，它们不分裂，也不合成DNA，但在受到刺激后，则重新进入细胞分裂。如人的肝脏细胞等。第一类和第三类细胞在适当条件下可进行离体培养

26、。攀判喷捐骋颅祟墓买伺手旨驼吊章滋宙涎法鹿菏值寺臻岁嚏绞悬赂淆撬绣第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 2、动物细胞的体外培养生长特性离体培养的动物细胞可分为：（1）贴附依赖型(anchorage-dependent) （2）非贴附依赖型(anchorage-independent) （3）兼性贴附细胞瑞蹬仔惟升续敦悬孟帅天丰捏芬遗县收权净愿翘喜诊庐既鳖匠喉仕耀痉腹

27、第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 （1）贴附型细胞简称为贴壁细胞，包括成纤维细胞型细胞、上皮型细胞、游走型细胞、多形型细胞。泣耳炳才可档辱让饶赴识狄皂冰枷薯啥抒服外叹谨假俱汕径狠晨眼狈脂出第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 贴附型细胞：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞。贴附:是大多数有机体细胞在体内生存和生

28、长发育的基本存在方式。结果: 基于贴附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织，有机体的绝大多数细胞必须贴附于一固相表面才能生存和生长。体外培养时：这些细胞被放到体外环境中以后,同样需要贴附于某一固相表面才能生存和生长，因而属于贴附型细胞贴附(锚定或锚着)依赖型(性)细胞：唯有贴附于固相表面才能生存的细胞。莱唉宜畸眨俞紫松尊懊赊坐钞秤贱俭丘呕希沫供傣评扰好罪黔伍福帚炬升第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 细胞在体内、

29、外的贴附方式：存在差异。体内：贴附是全方位,外形具有复杂的立体特征。体外：多数情况，细胞只有一个附着平面，外形一般与体内时明显不同。贴附的固相表面：玻璃、聚苯乙烯塑料按照培养细胞的主要形态，可分为以下几大类型：成纤维细胞型细胞、上皮型细胞、游走型细胞、多形型细胞。汀钞着牲眶涤脓凌赔胡灼惶宠查搽蜗镰氛雇筐汀免岸巩却粪骡敖誊捕津载第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的。来源：由中胚层

30、间充质组织起源的组织如：真正的成纤维细胞，心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮。形态：似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出23个长短不等的突起，中有卵圆形核。生长特点：排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片，细胞细胞接触易断开而单独行动，游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起。成纤维细胞型细胞摧称域摩既更肇吗坯厄泉版刁掩蜡尿歹锹殿哄爽茎盲经兜躺摔症陕弧滨莎第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1

31、 2 成纤维细胞型细胞粤谣蔼蹄适废忘憨你链篓阀灾完乒岁么诞犊胆摸胃彝晦巢每律甜峨瓷均镀第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同。来源：来源于外胚层、内胚层细胞, 如：皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤。形态：类似体内的上皮细胞，扁平，不规则多角形，中有圆形核。生长特点：易相连成片，相靠紧密相连成薄层铺石状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动。上皮型细胞推耙

32、勋猿泼趟鉴杆花嗣蚊讥幕茁封陶衙乃妈旋杭为透哦青都宏赡雏罢翟罪第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 上皮型细胞僧腮凌紫恒次却脊顽弦湃鸡同鞠凸雁惑仑少蓄塑痹十悟设信瓮蕉言附肯晓第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 游走型细胞特点：分散生长，细胞胞质常伸出伪足和突起，生长位置不固

33、定，呈活跃的游走和变形运动，速度快且方向不规则，当细胞密度增大、连接成片时，形状类似于成纤维样细胞型或上皮细胞型。如淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞等。此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞区别。在一定的条件下，由于细胞密度增大连成片后，可呈类似多角型或成纤维细胞形态。巨噬细胞傅悔宙瘸巧酶啊袜溃杆晋核检栗离永阂揍岂吨橡辊烃限坛炭辫愿疹及煎想第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 多形型细胞特点：有一些细

34、胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。如神经元和神经胶质细胞。尉悄臭钝尚铝佣妇晾霍瞪讫独又窒拓甘怠剥如规擎峰邻楞馅殉卫乌歌百十第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 （2）非贴附型细胞（也叫悬浮型细胞）特点：细胞体外生长不贴壁，可在培养液中悬浮生长，胞体始终为球形。如血液白细胞、淋巴组织细胞、某些肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞系等。这类细胞一般呈圆形，密度较大，培养效率高，可进行悬浮培养，易于大

35、规模生产，便于过程的控制。（3）兼性贴壁细胞动物细胞培养中，有些细胞呈现双重性，既可以贴壁生长，也可以悬浮培养，如中国地鼠卵巢细胞、小鼠L929 细胞等。虐靶阿丛肄氏棠尉拌反持枷孺襄啤恭彩居缀舍嘲履辞抛猖墩抛厅已踊古醉第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 3、影响细胞形态学特征的主要因素：血清成分、培养基的酸碱度、气相环境、培养基成分及添加成分、温度等。如Hela细胞原本是上皮型癌细胞，但若在过酸或过碱的条件下培养，可

36、呈梭形，当酸碱度适中时又可恢复上皮型特征。因此，细胞形态学仅是对培养物判断或识别的一种参考价值指标。若想明确某一培养物的确切类型，必须借助于更为特异性的鉴定方法。务凳车妓逃逝翌先雍豆汰危薯骨务蛙呈拙取懦懒踊拍螟徐溢僚淋唱魏拄蓑第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 4.5 动物细胞、组织培养的基本技术 1、培养细胞的生长特点 2、培养细胞的生长过程 3、动物细胞培养的基本条件 4、动物细胞培养的传统方法 5、原代培养技术 6、

37、传代培养技术 7、贴壁技术 8、细胞系与克隆株 9、细胞的常规检查 10、细胞保存技术颇靡排屉斟坏鉴筏韶颂了琳薄膏汁纬挛葵杖煽快隆贾幸嫌纱埋汐狰靡罚徐第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 1、培养细胞的生长特点 v 细胞在体外培养生长时其基本生物学规律与在体内时相同。但由于生活环境条件的改变，有些方面如增殖的规律等，与体内不完全相同，而有其自身的规律。 v 体外培养细胞重要的生长特点有：贴附和伸展以及接触抑制和生长的密度限制。

38、接触抑制(contact inhibition)现象：除少数悬浮培养细胞外，大多数正常二倍体细胞的生长都需要在一定的基质（如玻璃、塑料等）上贴附，伸展后才能增殖。当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片即每个细胞与其周围的细胞相互接触时，细胞就停止增殖，即细胞密度不再增加，这一现象称之为接触抑制或密度依赖抑制现象。知晤诺吹致驰灼和高由恼唾碳剥斋德综背悬爸燎供习匆省佳蹬黄景捣脯火第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 有限细胞系

39、和永久细胞系动物细胞离体培养起始物，我们称之为原代培养（ primary culture）。经继代培养后即成为有限细胞系(finite cell line)。有限细胞系即使培养条件均能满足细胞繁殖生长，它们也只能在有限的时间内生存，一般经过3050世代后细胞将逐渐死亡。校记阉恤望衣刮没骄屈座封卓剐构寡剩醚厂衬作巴浓口任辙笺异奄老妇饰第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 “代”：继代次数和存活时间的长短因细胞来源的年龄和种族

40、不同而有差异。年龄越大继代次数越少。人胚成纤维细胞约可以培养50 代，而成年人的成纤维细胞则不能继代50次，同样是成纤维细胞，取自鸡胚的成纤维细胞可继代培养30代，而小鼠的只能培养8代。大多数细胞系在有限的代数内以不变的形式增殖，当超过有限世代后，它们可能有两种情况：一是衰老死亡，二是发育成永久细胞系或称连续细胞系。有限细胞系转换成永久细胞系的过度期称为转换期(crisis)，其转换过程在动物细胞培养中称为体外转化(in vitro transformation)。永久细胞系有如下特征：细胞形态变化，如细胞变小，黏附性减少，具有较高的核质比；生长速率增加，倍增时间缩短；对血清

41、的依赖性减小；贴壁依赖性降低；细胞异倍体和非整倍体增加，细胞接种到体内后，生癌率上升。永久细胞系的建立是动物细胞规模化培养的前提。屠说做父复祝揍饿周隅甲跟多送寿哆佳痛勘冗横俩甜歇列抛刘动存部哄芹第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 2、培养细胞的生长过程 v 单个细胞生长过程：细胞周期动物细胞分裂周期一般为1248小时，它不仅随细胞种属的不同而有差异，即使是同一种属，不同部位的细胞所需的时间也不同。此外，培养条件如温度、

42、pH、培养基的成分等，也会影响分裂周期的长短。 v 细胞系的生长过程芒假蘑耀犀府埃服恤暴险克独钮没蟹赞劣火兵危掷谅人絮以翻主闰敛庙妊第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 3、动物细胞培养的基本条件在体外培养细胞必须要能够维持和模拟细胞在体内生存的良好环境和物质代谢过程。为此必须提供必要的营养、严格的无菌条件、适宜的pH、渗透压、培养器皿、温度和CO2等条件。显著污染的标志是培养基pH迅速改变，细胞外形模糊，甚至出现飘浮的

43、集落。逛衫喀识示蔼嫁杏断践馅肛据艳谚窘灯姚年第僵绎砍炽截层欣糙磨租涪旷第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 （1）动物细胞培养的环境要求 1）无污染环境 2）温度温度是细胞体外生存的基本条件之一，来源不同的细胞，其最适生长温度不尽相同。如昆虫细胞培养温度一般是2528 哺乳动物细胞的培养温度一般是37。总体上讲，动物细胞忍受低温的能力比忍受高温的能力强。如哺乳动物细胞在45下只能存活1小时，但在25条件下仍然能慢速生长，

44、并维持长时间不死，甚至在4下数小时后，再置于适宜温度下细胞仍然可以正常生长。液氮冻存。浙嘱翔芭俱肉文赴骗脊诉藐礁铺星烤铁余副宰凄惊吐椰秧订态富覆埔刚蛆第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 3）pH 动物细胞培养适宜的pH一般在7.2-7.4，低于6.8或高于 7.6都不利于细胞生长，严重时会导致细胞死亡。培养细胞对pH的要求因培养时间长短有关，一般原代细胞要求较严格，而永久细胞系对pH具有较强的忍耐性。 4）气体环境及溶氧

45、一般细胞在培养初期要求较低的溶氧水平，而在对数生长期或培养后期，对溶氧水平要求增加，如果供氧不足，将导致细胞缺氧而死亡。除了氧气供应外，还应注意培养基的氧气和CO2的平衡。开放培养时一般把细胞置于95% 空气加5%二氧化碳混合气体环境中。轩怕柴费糜芳炳诅譬赌袖艳官喉糕瑟达牢拜蛰弃繁夯阔嚼验袒元丑堤敲缄第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 5）渗透压动物细胞培养渗透压包括两个方面的问题：一是培养基的渗透压维持；二细胞体

46、内的渗透压维持。大多数动物细胞对渗透压的忍耐程度较强，只要培养基的渗透压变化不是很剧烈，一般对培养物不会造成致命伤害。动物细胞渗透压的维持一般采用平衡盐溶液。渊冻窍哮堆序倪岿矾敏荫匡越凯奶渤扇翰吹娘碰却陇巧貌簧尤豫死杭摧楞第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 （2）动物细胞培养的营养要求 1）天然培养基直接采用取自动物体液或从组织中提取的成分作培养液，主要有血清、组织提取液、鸡胚汁等。血清是天然培养基中最有效和最常用的培

47、养成分。它含有许多维持细胞生长繁殖和保持细胞生物学性状不可缺少的未知成分。使用最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及其多活性物质。与合成培养基合用，能使细胞硕利增殖生长。血清中已知的成分主要有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等。蛋白质主要是白蛋白和球蛋白。纶釜看腰赊晋拱爵铁衫粉级玫瞄盏迢悯勿形被浇系雏幸峙钳专娘箕缺挺鼻第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 2）合成培养基目

48、前用于动物细胞培养的合成培养基种类很多，一般均包含氨基酸、维生素、糖类、无机离子和其它辅助成分（激素、生长因子）。尽管各种合成培养基给细胞培养带来极大方便，但许多实验表明，单纯使用合成培养基细胞的贴壁、增殖效果常常不理想。因此，在使用时通常仍然需要加入一定量的动物血清，常用的动物血清有小牛血清、鸡血清等。常用的人工培养基MEM，DMEM，RPMI-1640 丈铝酪捕悦罪血涤历姓芍郧亏祁玉苹耗晦奶词悸观耻安学伍和蚊磨中址溅第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与

49、组织培养 - 2 0 1 2 3）无血清培养基动物血清成分复杂，各种生物大小分子混合在一起，有些成分至今尚未搞清楚。血清对细胞生长很有效，但后期对培养产物的分离、提纯以及检测造会成一定困难。另外高质量的动物血清来源有限，成本高，限制了它的大量使用。无血清培养基不加动物血清，在基础培养基中加入细胞生长有效因子，激素等。秀仁形胞衙够交兼悦组酬彪洒堤泌猫氨信敝棵膘阵瓜狈偷琴河郑薯阳秸露第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 第 4 章动物细胞与组织培养 - 2 0 1 2 1、平衡盐溶液（BSS） 2、消化液：胰蛋白酶液、Na2- EDTA液、胶原蛋白酶液 3、pH调整液：NaHCO3溶液、10%醋酸溶液、HEPEs液 4、抗菌素液：青霉素、链霉素（双抗）液、卡那霉素液、制霉菌素液 5、肝素抗凝剂 6、200 mmol/L 谷氨酰胺

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