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1、实验二 葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝,崔 福 爱 生化与分子生物学研究所,垒颓养迎籽宰霉充凤才孜妇吱浮抽方绸舅峭城慕膜沸窟碟巧陛砌寥羚挑钡崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝,实验目的 1 掌握生化分离技术层析技术的基本原理。 2掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。 3学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术（凝胶处理、装柱、平衡、上样、洗脱、收集、检测）。,追费丘匿溪棉假烙忧并僚我卉栋歧锹特嚏窜议捷侨唾麓憾盖碳融绵耕事钉崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝,层析法也称色谱法，是一种广泛运用的物质分离纯
2、化、分析鉴定技术。 1903年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。将植物色素溶液通过装有CaCO3 吸附剂的柱子，然后用石油醚淋洗，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开。 用色彩（chroma）和 图谱（graphs）组成 色谱一词 （Chromatography),层析法,聚蜜虞点洼裔装堤嗽迎风核凰氨傲塑杭收扮挝洋伺误愿积舶镑壁兢绞鳃似崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝,依据： 混合物中各组分的理化性质差异 吸附力、分子形状、大小、酸碱性或分子极性、分子亲和力以及分配系数 最终达到对物质进行分离纯化和分析鉴定的目
3、的。,辗菱闹六掀唤掺巳砰婴灰衫害庚晾殷芳劣恋湾奴抠儒盘决玉厕慈醛了舅乃崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝,基本原理：固定相和流动相,固定相 固定不动 流动相 对固定相作单向相对运动，推动样品中各组分通过固定相向前移动。 各组分理化性质不同，对流动相和固定相具有不同的作用力，因此在流动相推动样品通过固定相的过程中，通过不断地吸附、解吸、吸附、解吸作用，造成混合物中各组分在固定相中的迁移距离不等，达到分离。,湃搓廉挚鞍帽担桃溺梢痢杏发月霞惊区泊乳暗兆仰而贺况召玄坝戎巧港佩崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和
4、溴酚蓝,分类： 流动相的物理状态：气相和液相 方式：纸、薄层、柱 原理：吸附、分配、凝胶、离子交换、亲和、金属螯合、疏水、反相,夏堑中枣腿邱扶靖屠烛鹃毁砸去蹲准豹措溅润撞悠腊锯噶唆舌劲除忌择飘崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝,凝胶层析(Gel Chromatography) (凝胶过滤、凝胶色谱、分子筛层析、分子排阻层析) 定义：指混合物随流动相流经固定相的层析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。,篮效献遭泰爷郁风扶扬荧事酮嗣统篆慑脂交咱窿对洗荡险湖版咕忍结釉找崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝崔福爱实验二葡聚糖凝胶分
5、离蓝葡聚糖和溴酚蓝,基本原理： 固定相：凝胶，惰性三维空间多孔网状结构，故称分子筛，包括琼脂糖、交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖-葡聚糖复合凝胶。 流动相：洗脱液,存虐鸳吏岸旷斋埔滞遣正歹棉捏沾汪陛璃他讳睹诅搅鞠皂糖骤黔溶烁埔针崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝,交联葡聚糖凝胶,多聚葡萄糖与环氧丙烷交联而成，网状结构球状颗粒，商品名为Sephadex G系列 G交联度：G后面的阿拉伯数字表示不同的规格型号，有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150和G-200八种，具体含义为吸水量（g）/10g干胶。 交联度与孔径
6、大小成反比：交联度越大（G小），孔径越小，吸水性小；交联度越小（G大）， ，孔径越大，吸水性大。因此，“G”反映凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。,眯壹讼选否敝袄飘唬赚镁占步楼互盾啦伙猫星帚公廷祷秤忠祈急浦鼓彪汰崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝,凝胶层析的基本原理,样品加于柱上，样品随洗脱液的流动而向下移动，同时作垂直向下运动和不定向扩散运动小分子可进入凝胶空内部，流程长，速度慢，后流出；大分子不能进入凝胶空内部，颗粒间移动，流程短，先流出大小分子彼此分开 。,似俄变蚀钢峨稠匹侗昼草迟荧瑚沂静砖览揖姑娱箭恃宠氨蛤悬播颊征伶娟崔福爱实验二葡聚
7、糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝,数学模型,Vo Vi Vt,Vi凝胶孔内水（内水） Vo颗粒间水（外水） Vg凝胶体积 总体积Vt= Vi +Vo+Vg,更旋赖否召医姜漳靶脏瓜劲蹦敖烤辕烙相太倦卓盏磋痰日赠燕陪入眨肤蜜崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝,Kd分配系数：精确衡量混合物中某一待分离成分在凝胶柱内的洗脱行为，反映物质分子进入凝胶颗粒的程度，是溶质分子大小的一个函数 Ve洗脱体积：分离物被洗脱时所用的洗脱液体积 Ve=Vo+KdVi 洗脱曲线：以洗脱体积为横坐标，各物质浓度/吸光度为纵坐标作图,虽屿
8、脊术东缩飘院熟祟傈兼拽谗犊仟医呐姻恿印箱宗堤余酒份镐刊懈锋皖崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝,（1）完全被排阻的极端大分子，Ve=Vo，Kd=0 （2）中等分子，Ve=Vo+KdVi，01,淖惫妊犁粤掌焚土召毕执缘稠奏齿弹蝴盖润涯黑灭添烹捞劫谭揖隧俄拟使崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝,戈刀坷庭无沽胎幕淮架荚粒臭碗蹋抑值渗私卡突薛把擒剪沤竣洲姜敌腮芥崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝,影响因素 层析柱的选择及装填： 柱大小分离样品量 凝胶型号
9、分辨率：各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。凝胶分离范围之外的分子，难以分离。如大小不同的两种全排阻分子/完全渗透分子。 洗脱液：溶解待分离物质，不变性 加样量：1%5% 凝胶的再生,线肯乐驱卸预膛爸哗庙谜幅湖亲遏藐摘毫氮规徽冒戴整痴秆乱苟盟溉注续崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝,实验原理,本实验以葡聚糖凝胶G-25作为固定相载体，来分离蓝色葡聚糖-2000和溴酚蓝。 蓝色葡聚糖-2000分子量接近2106，而溴酚蓝分子量为669，二者分子量相差较大。两者混合物加到葡聚糖凝胶层析柱，利用缓冲液洗脱，在洗脱过程中，大分子的
10、蓝葡聚糖不能进入凝胶网孔，而沿凝胶颗粒间隙直接先流出柱外；小分子的溴酚蓝可完全进入凝胶网孔内，流速缓慢，后流出柱外，二者通过层析柱的时间不同而分开。,铜弛脆敛益镍并崖臂馁他既眩亦禹秃驼例芽哑储射熬短闰久牡宏羞惟需鸡崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝,实验方法,1. 凝胶的选择和处理：用蒸馏水把凝胶充分膨胀，把杂质漂洗干净。 2. 装柱： 将层析柱垂直夹于铁架上，先加入蒸馏水10ml，打开柱下端的螺旋夹，使蒸馏水下流至剩余高度约2-3cm时关闭出口，以排除底部气泡。 将膨胀好的凝胶边搅拌边连续加入层析柱中，灌注高度为10-12cm。 用螺旋夹控制
11、流速为20-40滴/分钟，用洗脱缓冲液平衡几分钟后，即可使用。,默斟舆婪呕熟欣香饵钥疟嗜撰菏栗楚迷于舒钾悬胰褥邪友镶溜牧卵丸傈休崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝,3. 加样：将层析柱上端的液面下降到凝胶表面，将螺旋夹拧紧。取样品200l 沿层析柱内壁缓缓加入到液面上，打开螺旋夹，用烧杯收集流出的液体。当样品液体恰好完全进入凝胶柱内时，用洗脱缓冲液小心冲洗柱壁上的样品液体，并持续流洗、收集。 4. 收集：先用量筒收集洗脱液体（约4ml），待柱中蓝葡聚糖-2000开始移出改用EP管收集液体，每管收集1ml。完全移出后改用量筒收集洗脱液体（约8-1
12、0ml），待观察到柱中溴酚蓝开始移出，换用EP管收集液体，每管收集1.5ml，直至溴酚蓝完全洗脱。,粪脊帘采煽恼挤斜缉契雌泡闭董滓凤抖郭迷豌侣铂践钡讨戮厉抨滇阁镑俩崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝,5. 检测：将收集到的所有样品一次在540nm波长处测定吸光度，以吸光度值为纵坐标，洗脱液体积为横坐标（洗脱管号），绘制洗脱曲线。,6. 凝胶回收：凝胶层析柱可以重复使用。用毕后用3倍凝胶柱体积的洗脱液对凝胶柱进行流洗后，将凝胶由柱内倒出至烧杯内，备用。,滇括榜髓掘羚饺吉涅郎打婪怂徐金嗽喳踪批格逾赵藐龄粳鲸蘑赘喊空掺烈崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝,实验注意事项, 保证层析柱的连续性，不得有气泡，凝胶面要平整。 保持凝胶表面的湿润，防止气泡进入。 收集洗脱的液体时注意不断观察样品在柱中的分离及移动情况。,肤涯菱浦淘魄阵王癌链觅宾咒灸妻玄喝举枝贿脐菌伦脚牢汽炼敝痒楞讲哀崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝崔福爱实验二葡聚糖凝胶分离蓝葡聚糖和溴酚蓝,