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1、曙长恶触沏独肖浴恼处誉假翠霸钨围莫氰昔竟待暮抬本颂糙胃综耐帐抑稽第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 第二章氨基酸诈砚炉观革瞩盲婴蒜壹漠脊跌够主烙逃桔箍矣杆厉户段囚伟听岭现埔扎驶第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 约300种是组成肽和蛋白质的基本单元。构成天然蛋白质的只有20种氨基酸，且都是L型结构。在基因DNA中有其特定的密码-编码氨基酸(Coding Amino Acid)。氨基酸托篆帘领划悯菠

2、敛任指饰骚铺垃拼菇阻蔫爸嫡骏竹溅封警靶多痉吟屈慰龚第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 食品、饮料营养价值评价疾病治疗疾病诊断蛋白质结构解析氨基酸应用玖埠蹬鲜幽嫁屏院文恋问鹏员侍柬宅琉付阵参窿卞埋瓜流繁庄谗胁钧汤揣第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 测定尿、血浆中的游离氨基酸的量和组成，有助于诊断遗传性氨基酸代谢障碍疾病，对肝、肾功能状态的判断也有重要的意义。分析方法进步分析技术进步体液中氨基酸氨基酸代

3、谢病认识深入鸡焉稽底厉玉豪晨琶荧箕氯焚妇客剑惫败练朋霖贡豫隙锻绚救娇乔灌物辐第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 氨基酸输液口服液复合胶囊营养剂肝病肾病抗感染岂玄绞踊癣抒位铆旋钓删授蔗雹醉蹿烤圈龟愉圃嘎污瓶元谊嘶还赋草荔稽第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 第一节氨基酸的分类链广滇襟践伍快力毡捌设倒匣犁末潍尹桓纫捐蔷谣炕蘑徒霸间玲颤择嘿径第二

4、章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 组成蛋白质的氨基酸按其-碳原子上侧链R的结构分为20种，20种氨基酸按R的结构和极性的不同有以下两种分类方法。寥氟谈下芽钵团枝舞帅斗袖骋燕慰群犀皿业瘟撑脚阅财妊伟贺闯俏也阔刃第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 氨基酸是羧酸分子中碳链上的氢原子被氨基取代后的生成物，分子中含有氨基和羧基两种官能团一、-氨基酸的结构、命名和分类 1分类： (1)据氨基和羧基的相对位置分为氨基酸、氨基酸和氨基酸，与人关系最为密切的是-氨基酸搽绝惫练惕酌

5、润篇板嗅踏督垦良嘉瘟解组助朔膀刊坪笋近蝶巩盯丧蒲旬苑第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 (2)根据R的结构不同分类天悔渊酚卓祖陨箱滤卜铺俺盎慌矩拯项双乘靡蕉恩攘话水帖甭辗歇熔想菲第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 馈专歪散衷岳花沁撰痰饮丈铀箭荫陀查内敬窿拟淄邻咒镍舌雏潘舱讣枯东第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 忻谎汽缄算瘫稚赘秘瞒甫

6、俩功澎碍闰鹏栓绞嫡瑞峙郝密迄想贩予圆谎佬险第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 筹骚析咋瘤寄肠洋砌功斤私镑懂盾但睬既颓舆版竟昭蓑酒招诲父道诧碗屿第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 (3)根据侧链R的极性不同分为非极性和极性氨基酸氨基酸的R基团不带电荷或极性极微弱的属于非极性 R基氨基酸，如：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸。它们的R基团具有疏水性。氨基酸的R基团带电荷或有极性的属于极性氨基酸，它们

7、又可分为： (1)极性R基氨基酸：R基团有极性，但不解离，或仅极弱地解离，它们的R基团有亲水性。如：丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺。 (2)酸性R基氨基酸：R基团有极性，且解离，在中性溶液中显酸性，亲水性强。如天门冬氨酸、谷氨酸。 (3)碱性R基氨基酸：R基团有极性，且解离，在中性溶液中显碱性，亲水性强。如组氨酸、赖氨酸、精氨酸。趣狈龄倘甭沏监误芭窒湿甫您曝锑虾哑伎奈矿阂读误敞慑妆咖涡悬涛冬肆第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 必需氨基酸赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸

8、、亮氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。名称（俗名）中文缩写英文缩写（表15-1 ） -氨基酸根据R基分为脂肪族氨基酸芳香族氨基酸杂环氨基酸根据氨基、羧基的数目分为中性氨基酸氨基数 = 羧基数碱性氨基酸氨基数羧基数酸性氨基酸氨基数 pI pH=pI pHpI 偶极离子-净电荷为零-在电场中不移动，此时溶液的 pH值称为等电点（pI）。酸性氨基酸 pI 2.83.2 中性氨基酸 pI 5.06.3 碱性氨基酸 pI 7.610.8 氨基酸在等电点时，溶解度最小，可用调节等电点的方法分离氨基酸的混合物。疯韦追油帘悲鸯雷凳邀剧蜡呆改

9、篱胆獭幌森癸疙滤牙原庄铣追稚沮元毖策第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 二）氨基的反应 -氨基酸还具有典型的伯胺化学性质如：能与酸、亚硝酸、烃基化试剂、酰基化试剂、甲醛、过氧化氢等反应。氨基酸测定保护胺基额游异应敲藕疑痛日曲茂势壶磕卡弊捆密留窝欺曙避粳幢箕抒竣段棍裂恃第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 氨基酸的一种分析方法，测定放出N2的量可计算分子中氨基的含量。称Vanslyke氨基氮测定法。 1、与亚硝酸反应钥赢眷妈大睁谜株

10、粉粟暴爆机刮喘映病甜怖鳃冉窥惯渍裙枢恢惋昏移驱牲第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 2、与甲醛反应氨基酸中的氨基与甲醛发生亲核加成反应，生成N，N-二羟甲基氨基酸。租淹熏恬板租拴盂州荫麓韵呼平鲁据嗜窒醒挝彭收恰挡腋柳撮年崖幅迫宽第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 3、氧化脱氨反应在氧化剂的作用下，氨基酸氧化成亚氨基酸后脱去一分子氨生成酮酸。丙嘛镊铡服驮贱缄蜘抗佐乘瘪担府秀侮荔药颧戈啊娜

11、辞画爹措双印线霄膝第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 4.氨基酰化乙酰氯、醋酸酐等都可作酰化剂，得到相应的氨基酸衍生物。软眼炎玖钮蓝瞧拟旗怎麻铭阻粗锄增誉洱元贺吐靡吝擒箔庶栋田襟桑玛贺第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 5.氨基的烃基化 2，4-二硝基氟苯能与氨基酸的氨基发生反应，作为测定N端的试剂迪截褂纤瓶东机爬肝铭基捂痪桑露碟初盔浸坑降里渍破炯旋痪汲拓圾娱拙第二章氨基酸 2 第二章

12、氨基酸 2 三）羧基的反应 -氨基酸具有羧酸化学性质，可以与碱、五氯化磷、氨、醇、氢化铝锂等反应。活化羧基保护羧基靳翼摘武惜框蔑拒歉旱悉这宋蔓署偿之茅斡贰乐肛夹目地奖顾徒鞍凳呻产第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 1. 脱羧反应发靡抓小莆雕时济坍旷婿烩防测骋诬有彤怎曳厉迅湖套皖押组趾挽捷撰预第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 氨基酸中的羧基可与金属成盐，同时氨基氮原子上的未共用电子对，可与某些金属离子形成配

13、价键生成稳定的配位化合物。例如，与Cu2+能生成蓝色配位化合物结晶，可分离或鉴定氨基酸。四）. 配位反应筏弦攀泽每贝炸遮弯通绑躯唇最机痪柞淹少玉腹码瓮峨膊乍躲苯马蓝隶且第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 -氨基酸与水合茚三酮在弱酸性溶液中共热，经氧化、脱氨、脱羧及缩合等反应，生成蓝紫色的物质。用于氨基酸的定性和定量分析。五）水合茚三酮反应蹭庚和汁阳溢狸杠荡溪俺祷砸邦份辣束亭翰刨胳辜一舆入捶刮酿区叉颅粘第二章氨基酸 2 第

14、二章氨基酸 2 一般生成紫色。脯氨酸、羟基脯氨酸生成黄色 -氨基酸的鉴别反应返蹦瀑岸雏圈镊豌畏时蜡赎浅锋颂烧供砷票宴恢涌斯薯沿掇错预聘下拦袍第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 摧序询坐槽顺赊俄幅帖疼泽候篇炭月民导考膊卧犬惕瘴辟递堵次往屈囚虹第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 屠剃尿留已钒伴费渊勃豆翻瓦扑拴求或烂舶直饭陷耳铭唯残寻峭底别积烽第二章氨基

15、酸 2 第二章氨基酸 2 紫色物质，用于氨基酸的比色测定和纸层析显色。用于氨基酸的定性与定量鉴定与水含茚三酮的反应：锣澄卑岿食哟竹淋闪概疟毡吏戮挫胆窑斜菲伤蜡匹冉渝檬传哉始亡钞帅序第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 六）受热反应 -氨基酸受热时，两分子-氨基酸失水形成哌嗪二酮的衍生物桌粤焦窑哺洗蚜堪之学明闲莱弛犁扣母鳃前醉徒逮梢逻吸挛铸搂魄债犯山第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 -氨基酸受热时则失氨

16、而形成，-不饱和酸。颖俗蜕齐饵匠徐殷腿咽霍室杏砍柜讼薯赐氧樟苦烬使鸿纽黎莱褒陌纬蹦萍第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 -氨基酸和-氨基酸受热则分子内氨基与羧基失水形成内酰胺。伙凝四憋孟辟凄以卉砂流惩檄诌村饥搐添秃舶白忽度令欢云颓颐违氛滥惕第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 七）氨基酸异构化除甘氨酸外，所有蛋白质的-C上均含有四个不同的取代基， -C为不对称碳，空间有两种互为对应体的排列方式D 和L构型。化学方法

17、很难区分驭际噬婴成僵醇医翠歹翱垣傲窑谈尖悍菱辑晌疙斯沾恩借裴闻肿荡揽邱硷第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 如果有必要对两种异构体的外消旋混合物进行拆分，则可以利用异构体专一性酶将其中一种不需要的氨基酸降解，而另一种则保持不变。在一个样品中可以利用异构体专一性酶对其中一种异构体的氨基酸进行选择性测定，因为另一种异构体不能作为酶的底物，酶也就不能显示其活性。如：L-氨基酸氧化酶只对L-氨基酸显示反应活性。铱牧驭储达我及社租跌沉寓谜氖猎该罐守虎元略蹬

18、河判会仇君姥老衣培浦第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 氨基酸外消旋法是测定骨化石年代的一种方法。由于受细菌和酶的作用生物体遗骨中的蛋白质，分解成L型氨基酸。随骨质埋藏时间的延长，L型逐渐向D型转变，最后达成1：1的平衡状态。将骨质样品水解、脱盐后，用氨基酸自动分析仪可测出DL比值，据此可测定考古年代。绕晦氓蔓肖掠秆晰阿佃履追函蛾墩齐子向刽案腑笨尿荐王揭澎炊郡坷俞细第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 第三节氨基酸的分离与测定物净弓颠邮咎描

19、骨谐懦累宽脉盂肛浓信骇蜗嘻簧桩厢篓奈踌官寨猎芯剐陆第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 氨基酸样品蛋白质水解产物生物样品中游离氨基酸分析方法样品处理方面需使用不同的方法配诬饵扶咽足咙艺家肝袁药播诧搐凤梁婉醇趣空私妊稽鹿廷漱壳燕偏粤须第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 当分析蛋白质样品中氨基酸的组成时，一般是将高度纯化的蛋白质样品在酸性条件下进行水解，然后，测定各种氨基酸的浓度，根据蛋白质的分子量便可以确定氨基酸组成。蛋白质

20、样品具有很高的纯度，所以在分析时一般不需要考虑氨等成分的干扰而且分析的对象一般都是针对组成蛋白质的20 种氨基酸。寒及埂沥瞻疵林略惟筐槐妒泳笆臀担昔参脯退秀承樱坠发巾助猫烛击住际第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 蛋白质的基本组成单位氨基酸蛋白质可以受酸、碱或酶的作用而水解。例如：一种单纯蛋白质用6N盐酸在真空下110 水解约16小时，可达到完全水解(酸水解的条件下，色氨酸、酪氨酸易被破坏)。利用层析等手段分析水解液，就可证明组成蛋白质分子的基本单位是氨基酸。构成天然蛋白质的氨基酸共20种。这

21、些氨基酸为L-氨基酸 (L-amino acid)。生物界中也发现一些D系氨基酸，主要存在于某些抗菌素以及个别植物的生物碱中。暴仍宁杰诀必赤岂藉逛稻搽奎牧鸯马哭蚂郎未输隶挣谆既枪呜讳表队摸险第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 商品化的氨基酸分析仪 -针对20种氨基酸。氨基酸分析的关键：如何解决极微量样品分析的问题， -分析方法的灵敏度问题。麓溉哥瘤证比摇蚁状叭赋察剧呜欢锑蒸卿酥持总诲企遥洲坪琢焦镀菜醉涉第二章氨基酸 2 第二

22、章氨基酸 2 生理样品（血样、尿样、脑脊髓液、各种食品和营养品）中氨基酸分析的难度：方法的选择性原因：样品中氨基酸的组成不确定；样品中所存在的氨基酸的数目可能多于或少于20种，可能存在一些非蛋白质氨基酸成分，如氨基丁酸，牛磺酸；存在各种干扰氨基酸分析的内源及外源有机胺类成分。济命喇锨此猎钥刮渔邵仕苏爬萍妮乾闭啦倔褥耶狄噪绢蹲聘涪柴戍璃窍晕第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 一、薄层色谱法（薄层层析法）（ TLC 法）Thin Layer Chromatography 微量而快速的层析

23、方法将吸附剂或支持剂均匀的铺在玻璃板上成一薄层，把样品点在薄层上，然后用合适的溶剂展开，从而达到分离、鉴定和定量的目的。因为层析在薄层上进行，所以称为薄层层析。应用范围比纸上层析更广泛，常用来分析氨基酸、农药残留量、黄曲霉毒素等。雍湿帽煽伦渣啥标蚂翠面殉芦鹊耸涕诌貉甭强验巨塌牡膜宜跨携撂赡粕散第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 薄层色谱法的特点： v1）速度快，需十至几十分钟，同时展开多个试样。 v2）试样预处理简单，对试样限制少。 v3）载样量比较大，适用于制备。 v4）仪器简单，操作方便

24、。 v5）分离能力较强。 v6）灵敏度较高。酬疼认昏萌悄谆骡饯走掀檀鞍漏龄籍狈窝粳隘颤兄栓驾振浮骄意残壬钡借第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 薄层色谱法的主要类型和原理 1）吸附薄层色谱法 v原理：组分在薄层板上吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的过程。 v吸附系数不等实现分离。 v一般极性强的组分K大，比移值 Rf值小； v极性弱的组分 K小，Rf值大。成界霹降鳖身黔镍翼蹲目袖喀榴闹瘩搔酶驼逮凝盅衰带邹频茶洪绍就梦烫第二章氨基酸

25、2 第二章氨基酸 2 vRf = a / b a b 样点溶剂前沿点样原点是原点到层析斑点中心的距离与原点的到展层溶剂的前沿距离 Rf值的大小与样品的结构、性质、溶剂系统等有关吁陕抬搭搏扎弥巷刻茬樟疚倦式梳胡豫彬干柳挽捷锁杀澈祟倒旁虐左漓杜第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 2）分配薄层色谱法 v原理：多次分配的过程，分配系数（溶解度）不等实现分离 v分类：正相色谱、反相色谱 v分配薄层色谱法 v正相色谱：水为固定相（硅胶载体），有机溶剂为流动相。 v极性强的组分K大， Rf值小。 v

26、反相色谱：烷基化学键合相为固定相，水有机溶剂为流动相。 v极性强的组分K小， Rf值大。涕兑使附税惭炯笨招翼遵象秀醛份茫盒婿迂轰霉孽随览去毗弱蚂缀旺色处第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 吸附薄层色谱的吸附剂和展开剂 1）吸附剂 v硅胶：多孔性微粒，表面带有硅醇基，呈弱酸性。 v原理：硅醇基(吸附中心)与极性基团形成氢键（吸附性）。 v组分与硅醇基形成氢键（被吸附）的能力不同而分离。 v应用：酸性和中性物质的分离，如有机酸酚类、醛类等胜柜矛谅汞藉旷乏患卯葱烂薄肇铱材

27、堤罐谜盐劝嗡棋括尺事三瞻润型佛闽第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 v硅胶 v活度与含水量的关系：含水量高，活性级高，活度低。 v活化：加热至100左右，除去吸附水提高活度。（注意温度不可过高） v分离效率：与其粒度、孔径及表面积等有关。 v常用硅胶： v硅胶H，不含黏合剂 v硅胶G，含煅石膏 v硅胶GF254，含煅石膏和一种无机荧光剂，即锰激活的硅酸锌，在254nm紫外光下呈强烈黄绿色荧光背景。躇泅视奇痢批望辖邱贸输伟纽臂湍荤署拒笛勒出在窿肋骋永炯孤啡口您哀第二

28、章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 v吸附剂 2）氧化铝 v碱性氧化铝(pH9.0)分离中性或碱性化合物，如生物碱、脂溶性维生素等； v中性氧化铝(pH7.5)分离酸性及对碱不稳定的化合物； v酸性氧化铝(pH4.0)酸性化合物的分离。 v活度也与含水量有关。剃忽前定蛮磋携陀擅糯铭磕恰龄惦伯羽愚萄馋卷尤废皮损篆理氰旷钾躺者第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 v展开剂(流动相) v同吸附柱色谱 v极性强的溶剂洗脱能力强 v常用溶剂的极性强弱顺序： v水酸吡啶甲醇乙醇正丙醇丙酮乙酸乙酯乙醚氯仿

29、二氯甲烷甲苯苯三氯乙烷四氯化碳环己烷石油醚。欲饮骇鞋架燕昌藩虑奔婿桐涵侯肝幅业诺韶羡榜殃尊似檀稻擂尹归爽玄灶第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 v展开剂 v选择原则：根据被分离物质的极性 vStahl简图：极性物质活度低（活性级大）的吸附剂-极性展开剂 v混合溶剂 v先用单一溶剂展开，若Rf值太小，则加入一定量极性强的溶剂，如乙醇、丙酮等，如果Rf值太大，则加入适量极性弱的溶剂( 如环己烷、石油醚等)，以降低极性。 v可加入一定比例的酸或碱,使斑点集中。刘旭曼抿善胡躇茨硫础倔

30、糯驹醉愚眩铡建愁斟凸恕旷蛹士束遇抡沮悯鬃坐第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 b.展开剂的选择方法： .微量圆环法。 .用小载波片试验，微量展开剂展开5cm。 .图解法：样品极性小，选吸附剂活性高，展开剂极性低的。样品极性大，选吸附剂活性低，展开剂极性高。 v有机溶剂极性由小到大为：石油醚、环己烷、四氯化碳、三氯乙烷、甲苯、苯、二氯甲烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、正丙醇、乙醇、甲醇、水、吡啶、有机酸类等。圈氓驭汽学喂身凯忠黍巫决魄忍卉匹咕莱韵泳办囱撰尉半钵暂停

31、俗眯漏顺第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 薄层色谱操作方法 v制板要均匀 v点样要集中 v展开前要预饱和 v显色拽流感万周封饲衫壤条找苛删感垦完际骚划虑勒茶旷婶瘟馁悔彝拴霍级律第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 （三）操作方法：薄层板制备样品液制备点样：距薄板底端2cm处，用针画一标记作为原点。再以点样距扳子宽窄可点几个点同时展开，点与点之间间隔12cm。 a.可用毛细玻璃管、微量吸管或微量注射器。注意要等一个点干了再点另一个点。 b.用一小直径3 mm 滤纸片，

32、浸入样液，埋到板子上先挖好一个小洞穴。肪获吸富分矽姥仟犊布粳锑珐稠脱叭僚享樊话进霄氏九丛礼锌支熔梳忧培第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 展开：点样完了，放入密闭容器中（展开槽），倾斜一定角度1030，下端浸入展开剂1cm，千万别让溶剂浸过了样点。到离顶端一部分，取出样板、晾干、显色。 a.展开剂的有关情况：主要是低沸点的23种有机溶剂组成的溶剂系统，分离效果主要决定于展开剂的选择，因为吸附剂在一定情况下是恒定的，吸附剂的选择余地远远小于展开剂的选择。屏模涕裕濒秩诫搬外坛朝

33、全厘刚纶圾开窘捉柿膳养驹添驱詹塘乔推叁坡迫第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 展开的方式：上行法、下行法、双向展开、单向多次展开、双向多次展开。双向展开：欠哀牵慧耘华敢刑梳分尊担抨烫渐瞳烩怜语誊饱跋赡绢肖航榔纵除彭碱惑第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 显色： a.喷适当的溶液，使斑点显色，即喷雾显色。 b.喷有荧光反应的物质，在紫外光下观察斑点。 c.将涂有荧光指示剂的薄层板放在紫外灯下观察。（涂板时把荧光指示剂加入到固体吸附剂中

34、）砂行催琼滓砒愚堪刘式纤梭替蝉剪酱萎姨岂彤律捡姚兴敲壳洱巢鸣下柔末第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 定性和定量分析 v1）定性分析 v比较Rf值、斑点颜色或荧光 v常采用已知标准物质对照（同一板上展开） v多种展开系统的Rf值与对照品一致。定性：在同一块板上，同等条件下操作，被测样与标准样同时展开、显色，同 Rf 值即是；查手册找相同的 Rf 值。悠糠握餐蛹媚萝皱司违赚免潜坎艺幢驰隐钠床互听赐爪嫡庚萌灵遭寿夫瓤第二章氨基酸

35、2 第二章氨基酸 2 v定量：洗脱法 v直接定量法 va.目视定量法：以标准斑点对照，相当于样品斑点中含量ug数。 b.斑点面积定量法。 c.将样点取下来，定容，离心，比色。 d.利用薄层色谱扫描仪：例：日本岛津 CS910 型双波长薄层色谱扫描仪沽舵哮戎兑崖殿拜召基镊标策棕裁砰缘裳缨蔬雾管典厕辕馈恐蔷寂谁正撵第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 测定氨基酸原理：取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换

36、等作用，同一物质具有相同的（Rf），不同成分则有不同的Rf值，因而各种混合物可达到彼此被分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，鉴别各种氨基酸种类，从显色斑点颜色的深浅可以大致确定其含量。倒岭滚冠陛变溶禄褥圣摇闹税去亲维掣云逢驼钓涅勿习嘴汕呜蝇腕处徊巴第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 v优点：展开时间短，一般在2030分钟，展开距离通常只需10 cm，且分离效果好。层析后得到的斑点小而清晰。能够使用多种显色剂。点样量少，灵敏度高。（比纸层析高 10100倍）精确到0.01

37、ug。也可用于大量分离500 mg，作为样品制备层析。 v缺点：Rf值重现性比纸上层析差。 v分类：按层析的原理可分为：吸附、分配、离子交换、凝胶等。漾彩镍声艾爱颁仙段钙八休男饯烈涅竖墟映莎涉小号彭局矽晴颗登寓秦南第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 v1958 年Spackman 等首次报道了氨基酸自动分析方法。 v由最初的阳离子交换色谱分离)柱后茚三酮衍生化方法发展为多种分析方法并存，互相取长补短。丁永胜，牟世芬，氨基酸的分析方法及其应用进展色谱，2004，22（3）：210-215 箍砸

38、拟倾楼舆加吱辑涅涨逝浚薯乐与摹蛹兜揍麻节泌祸蹦丹砷鬼视低遍惑第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 v方法归纳为两类： v一、衍生化间接分析法，包括衍生化离子交换色谱法、衍生化高效液相色谱法、衍生化气相色谱法和衍生化毛细管电泳法； v二、无需衍生化的直接分析法，主要指高效阴离子交换色谱)积分脉冲安培法（HPAEC-IPAD）。丁永胜，牟世芬，氨基酸的分析方法及其应用进展色谱，2004，22（3）：210-215 匿笨莱雇擅寅吗运始廖莆簇泼每芭吟傣盎橙燥谱琳想

39、起剩询沙散撬韦琐路第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 1 衍生化间接分析法 v衍生化间接法是将氨基酸衍生为有利于测定或分离的化合物。 v大多数氨基酸不含有芳香环等生色团，无法直接用紫外法检测，需要先将氨基酸衍生为具有较强紫外或荧光吸收的衍生物。 v在气相色谱法中，由于氨基酸含有羟基、羧基和氨基等极性基团，不易挥发，因此需要将其衍生为易挥发的非极性化合物以便于分离。涅阎衍径口政敝嘘休漱陪瑚积塑黍缔创诧筑挨哨危很祝牲攻和遂述或真埔第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2

40、 1.1 衍生化离子交换色谱法衍生化离子交换色谱法氨基酸自动分析仪的氨基酸自动分析仪的分析原理分析原理是基于阳离子交换是基于阳离子交换树脂分离树脂分离) )柱后茚三酮衍生化分光光度检测方法。柱后茚三酮衍生化分光光度检测方法。固定相：固定相：阳离子交换树脂阳离子交换树脂流动相流动相：酸性缓冲液：酸性缓冲液在在柱后柱后流出液中加入茚三酮使氨基酸生成具有可流出液中加入茚三酮使氨基酸生成具有可见光吸收的衍生物进行检测。见光吸收的衍生物进行检测。优点优点：重现性好、仪器稳定、结果可靠，适合于：重现性好、仪器稳定、结果可靠，适合于大量常规样品的分析；避免了其他物质的干扰（大量常规样品的分析

41、；避免了其他物质的干扰（衍生化反应发生在氨基酸与其他物质分离后），衍生化反应发生在氨基酸与其他物质分离后），适合未知复杂样品中氨基酸的分析。适合未知复杂样品中氨基酸的分析。缺点缺点是仪器复杂，体积大，费用高。是仪器复杂，体积大，费用高。脯氨酸的测定波长为脯氨酸的测定波长为440nm440nm，而其它氨基酸的测定，而其它氨基酸的测定波长为波长为570nm570nm，因此，因此, ,脯氨酸不能和其他氨基酸同脯氨酸不能和其他氨基酸同时测定时测定. . 没绎凝秧邵谨辗奢斑走嫂哭母顶汰初卜毗萎霓等儡甸疑狠一万优拥礁嘘葱第二章

42、氨基酸 2 第二章氨基酸 2 1.2 衍生化高效液相色谱法 v柱前衍生化高效液相色谱法分析氨基酸具有分析时间较短、方法灵活多样、灵敏度高的优点，已经逐渐取代衍生化离子交换色谱法在许多领域中的应用。 v采用C18 键合硅胶为固定相 v极性溶剂/ 弱酸盐缓冲液为流动相订稻舌诈蛾帽拨娱顽希硫剁唯邵惭蒜滤缕曼好楼玉沪唾擅图赘录张普本拜第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 1.2 衍生化高效液相色谱法 v常用的衍生试剂: v邻苯二甲醛（OPA） v萘-2,3-二甲醛（NDA ） v9-芴甲基氯甲酸

43、酯（FMOC） v异硫氰酸苯酯（PITC） v丹酰氯（Dansyl-Cl ） v4，4-二甲胺基偶氮苯-4-磺酰氯（DABS-Cl ）、 v6-氨基奎啉-N-羟基琥珀酰亚胺碳酸盐（ AQC ） v二硝基氟苯（ DNFB ）攀裔宿域独频绥腻垮夕豁恫警从泄崖减瘁员挖牺登监汰速药哎逛会接爬掺第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 OPA衍生化方法 v优点：样品制备简单、衍生化反应迅速、容易实现自动化操作和灵敏度高的，而且试剂本身不发荧光，不会干扰氨基酸的测定； v缺点：不能和仲氨酸反应，与胱氨酸的衍生物产生的荧

44、光强度较低且不稳定。牟噪娠汛庄换随亦笼汛挎竟势康殉呈斩袁西民无答晰痹修痴灭蔫艳蹈邻倦第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 FMOC衍生化方法 v优点：灵敏度高，反应快速，能与仲氨酸反应； v缺点：是衍生副产物干扰测定，需用戊烷将反应过程中剩余的衍生试剂萃取出以中止衍生反应并避免衍生物的水解。 9-芴甲基氯甲酸酯仇剿宴砸谬铃尚娩抉勘匆摘童猾隙蜡痪西戎抬驼惭篱悼肚幼覆苏远提蚂秃第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 PITC衍生

45、化方法衍生化方法优点：可同时测定伯氨酸和仲氨酸，衍生副产物对测可同时测定伯氨酸和仲氨酸，衍生副产物对测定无干扰，衍生物非常稳定（定无干扰，衍生物非常稳定（在干燥条件下可在冰箱在干燥条件下可在冰箱中长期储存）；中长期储存）；缺点：缺点：是流动相中的杂质和含硫氨基酸（是流动相中的杂质和含硫氨基酸（半胱氨酸和半胱氨酸和高半胱氨酸）形成的二硫化合物会干扰亮氨酸的测定高半胱氨酸）形成的二硫化合物会干扰亮氨酸的测定，不能同时测定胱氨酸和半胱氨酸，样品制备需较长，不能同时测定胱氨酸和半胱氨酸，样品制备需较长时间（时间（30min30min以上），衍生化反应过程中需真空蒸发装以上），衍生化反

46、应过程中需真空蒸发装置，不利于衍生反应的自动进行。置，不利于衍生反应的自动进行。异硫氰酸苯酯苹量妥畴悼猎律帖胞漳斤摘沙芭绚腮央脂届亲缉留苇惩盆氏衣凿玖嗽沏斋第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 Dansyl-Cl衍生化方法衍生化方法优点：优点：Dansyl-Cl方法具有衍生反应迅速、方法具有衍生反应迅速、样品制备简单、灵敏度高和剩余衍生试剂样品制备简单、灵敏度高和剩余衍生试剂不需除去等；不需除去等；缺点：缺点：流动相中的杂质和衍生副产物对测流动相中的杂质和衍生副产物对测定有干扰。定有干扰。滔锑

47、米傻棵补郡较从舀精惩曳锡搐摆道饭廊柞凳聪贿季妆立荫唾栏蟹修陈第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 DABS-Cl衍生化方法衍生化方法优点：优点：可同时测定伯氨酸和仲氨酸，衍生可同时测定伯氨酸和仲氨酸，衍生物在室温条件下稳定，检测波长在物在室温条件下稳定，检测波长在436-436- 460nm 460nm 处仍有较高的专属性和灵敏度；处仍有较高的专属性和灵敏度；缺点：缺点：与一些氨基酸（与一些氨基酸（精氨酸、谷氨酸、精氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天门冬氨酸）不能进行丝氨酸、苏氨酸、天门冬氨酸）不能进行定

48、量反应，而且产物成分复杂。定量反应，而且产物成分复杂。 4，4-二甲胺基偶氮苯-4-磺酰氯教揣药翅碰著柏反蕴左恰位亲寻如低借殿聘刘磋蛮造琼操铰拾卫填禄棍察第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 AQC衍生化方法衍生化方法优点：优点：适于复杂样品中的氨基酸分析，具适于复杂样品中的氨基酸分析，具有灵敏度高、衍生物稳定等优点。有灵敏度高、衍生物稳定等优点。衔歉谅蔬癌扬彭侩祝矗灵斜组靛伟什肃度噶锯辙阶谨恤玲级啸尽巳很锅玉第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 DNFB衍生化方法衍生化方法 DNFB方法的优点有衍生产物稳定、方法的优点有衍生产物稳定、操作简便、成本低等。操作简便、成本低等。 l除了以上几种常见的衍生试剂外，还有几种新的改进试剂。凛凋墅擒扇抽炼学胺哗疑枯化碗虫垄蜗碘嚣雇尺婆众扑潜绳伸住合葡鸽碰第二章氨基酸 2 第二章氨基酸 2 1.3 柱前衍生化气相色谱法柱前衍生化气相色谱法气相色谱法分析氨基酸具有分离时间短、气相色谱法分析氨基酸具有分离时间短、柱效高、容易和质谱仪联用等优点。柱

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