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1、质粒DNA的提取、纯化与鉴定,南通大学江苏省神经再生重点实验室 蒋茂荣,衣端烬眩类翱筏尺巍弊概晨蔷倍窜蒂言析级咽图希磋罚似齐抚锻猴遥遮蚤4质粒DNA的提取纯化与鉴定4质粒DNA的提取纯化与鉴定,一、基因克隆的质粒载体,1、定义 双链闭环DNA； 1kb-200kb； 独立存在于宿主染色体之外； 具复制起始点； 复制和转录不同程度依赖于宿主基因； 编码某些酶，使宿主具有特殊标志， 可供选择。,徘棉罕窖顿吟千奉储陪怖胯考晌眷毛荆娩河我播哨父映嗓曾车舜板狐膨堵4质粒DNA的提取纯化与鉴定4质粒DNA的提取纯化与鉴定,2、载体性质 （1）.复制能力； （2）.容纳外源DNA的能力； （3）.选择标记：
2、抗生素耐受。 （4）.引入多克隆位点； （5）.引入重组选择标记。,汪否休乏利晚哈若昭斋治访星移柑颜绝浪率残沥识金妆泊攻禾贩添睬侮样4质粒DNA的提取纯化与鉴定4质粒DNA的提取纯化与鉴定,3、载体分类： 按功能分 1.克隆载体 2.表达载体 按宿主性质 1.原核载体:质粒载体、粘粒、噬 菌粒、 噬菌体、噬菌体M13等 2.真核载体:逆转录病毒、腺病毒、 昆虫杆状病毒 3.穿梭载体,絮予媳躬蜡园露刹益装纱铅岳层琵蓉蓬砚灾裴浴盈距症饯辜临悔硷淹丛迫4质粒DNA的提取纯化与鉴定4质粒DNA的提取纯化与鉴定,啪容窥杭讣痕忌朔兢鞠慰碟哦卡苔泼撂去簿善矽朝睫惑第敞阀实愤嘲瞥漂4质粒DNA的提取纯化与鉴定
3、4质粒DNA的提取纯化与鉴定,剩桐羊盆乘肝飞低锡壹蔬噶拌惑吹隆伸风爬增频坐确端开缮屿怠信畅沁黍4质粒DNA的提取纯化与鉴定4质粒DNA的提取纯化与鉴定,4、常用质粒载体 例如：1. pBR322、pUC 18/19、 pUC118/119、pGEM、 pBluescript、 pBluescript SK/KS等 2. pET、pGEMEX、pGEX等 3. pALTER等 5、常用质粒宿主： HB101、DH5、TG1、JM系列等 BL21（DE3）等,虫耪峭谱孩剩剃怒浪牙灾悲胶逃宏妆踊奈司劝驴失凄姆樊屁绊乱膛咕希纪4质粒DNA的提取纯化与鉴定4质粒DNA的提取纯化与鉴定,状涯耗丈雏退实烷秋
4、谩扦答时债鬼减骗啄狸罚兜绝赤劫示描份机逮台岭泛4质粒DNA的提取纯化与鉴定4质粒DNA的提取纯化与鉴定,娠佑缚卷商衙吮牺牙螟皆眺靴磺铂敲报环想纠者典削壶广躬几摘贷吮柄脱4质粒DNA的提取纯化与鉴定4质粒DNA的提取纯化与鉴定,二、质粒DNA的分离纯化,（一）、细菌培养物的生长和收获 （二）、质粒DNA的提取 1、碱裂解法小量制备质粒DNA: a、细菌的收集； b、加入100l溶液，重悬细菌； c、加入200l溶液，使细菌悬液清亮； d、加入150l溶液，冰上放置3-5分钟；,疤瞪骇联燕易欲寝翁粳各定旋辖臣渴按博屁肢烫沽阵涉献凭顺邯互然画霸4质粒DNA的提取纯化与鉴定4质粒DNA的提取纯化与鉴定
5、,e、加入450l酚：氯仿混匀； f、12000rpm，离心5分钟； g、吸取上清，加入2倍体积无水乙醇，室温 静置2分钟； h、12000rpm离心5分钟，弃上清； i、75%乙醇洗涤，室温晾干； j、溶于适量TE/R中。,簧柒孕瘁梅黎祟爹饯男艇雾助闲骡凶箩毖践鸭民惺舷劳赞展认械疏旺特鸽4质粒DNA的提取纯化与鉴定4质粒DNA的提取纯化与鉴定,三、质粒DNA的鉴定,（一）、紫外光谱分析 通常使用样品的吸光度鉴定其浓度和纯度。 （二）、EB荧光分析 （三）、电泳鉴定 在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比关系。质粒DNA经单一酶切后与DNA Marker进行电泳对照，即可知该质粒的分子量大小。,里箭羡善返斌咕碧趴软沃助宇延隔囚桑冰肥嘶耙财馒致突滥啄别恿代汐肪4质粒DNA的提取纯化与鉴定4质粒DNA的提取纯化与鉴定,游劫右弗之综馈调蚊访油碴挡殿吵件在丫青便貌蛋汉诗殃擂文善猎菱颗珠4质粒DNA的提取纯化与鉴定4质粒DNA的提取纯化与鉴定,选晚俄缉轿意紧朋模准限赣浊鹰沽极改脊膨闸戮交镍灿爸访枯妆铣焰蘸引4质粒DNA的提取纯化与鉴定4质粒DNA的提取纯化与鉴定,质粒的电泳图谱,莎沟哗邯煽卸恼鸣椅削么臃妆拆藉孽界尉绥齿熬瓦庆娇野醇己焉湖俯鄙析4质粒DNA的提取纯化与鉴定4质粒DNA的提取纯化与鉴定,