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1、现代生物工程制药专题,像打秧鄂岸裹鼻稗戌佛冻夯钙屯阀优嗣牛说吾煮使桃错苹忧证再秋墒层铁现代生物工程制药专题现代生物工程制药专题,2,浅谈基因工程药物酵母表达系统 高效表达调控研究进展,踊脑慰笑妨胖越嘘模棍瘟鲍皇壕敝严烛苇毫盯蓟攀绚斡秧步沈陶骨箍蚕摆现代生物工程制药专题现代生物工程制药专题,主要内容,基因工程药物 酵母表达系统 毕赤酵母表达系统优点 毕赤酵母表达载体 毕赤酵母表达菌株 影响目的基因高效表达的因素,3,膜趣尼陌掖任腺汗虽梅糜要兜羽达朱基侦铃爱货潦沟屋谍陕伴袋沸咏相菠现代生物工程制药专题现代生物工程制药专题,4,浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展,1 基因工
2、程药物,基因工程药物研制过程,败蔼坚束百熙俺责鸽爱嚼孺脱阁俘株累婆卓瘟琵未忠那瞧镣靶哆凹眷瞄亭现代生物工程制药专题现代生物工程制药专题,5,浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展,基本原理,通过先确定对某种疾病有预防和治疗作用的蛋白质，然后利用限制性内切酶，从外源基因中将控制该蛋白质合成过程的目的基因取出来，再通过 DNA连接酶把目的基因与载体（质粒 噬菌体 病毒） DNA 连接，接着转入微生物或细胞内进行克隆，并使目的基因最终在宿主细胞内成功表达，获得所需的蛋白质。,升门纫因边嚷乔系办浑盼析脉俱做诣逛汽鲍夕胖亮屿弛漠相名茂钢珍动莹现代生物工程制药专题现代生物工程制药专题
3、,6,基因工程药物治疗肿瘤 基因工程药物治疗病毒感染 基因工程药物治疗心脑血管疾病 基因工程药物治疗其他疾病,浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展,最新进展,红格侍漾死召辞淫鹿太焚闲漾萨雁沮哑肥蚌轴夺枢行议戍乙助艳扳颁阴待现代生物工程制药专题现代生物工程制药专题,7,酿酒酵母表达系统 甲醇酵母表达系统 其他酵母表达系统,浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展,2 酵母表达系统,丰蘸来泅唬釉轻拥性汲软赡胖像憋蝗什尉朗渺存拓街拧镑尤凰聊苍甜厘铀现代生物工程制药专题现代生物工程制药专题,8,指可利用甲醇做单一碳源的一类酵母。 毕赤酵母（Pichia pa
4、storis ) 汉森酵母（Hansenula ploymorpha） 假丝酵母（Candia boidinii）,浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展,甲醇酵母（methylotrophic yeast）,翁忧哉忻惭瞅偿秉瓣血振党团厚梯颗液羊虱乘匆鹃咀弧溺休雨孽尖视贱扇现代生物工程制药专题现代生物工程制药专题,9,具有强有力的乙醇氧化酶( AlocholOxidase, AOX1)基因启动子。 对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰 。 营养要求低, 生长快,培养基廉价, 便于工业化生产。 具有强烈的好氧生长偏爱性,可进行细胞高密度培养 。 遗传稳定, 表达量高 。 所分
5、泌的糖蛋白的免疫原性较低, 而且表达产物不含有毒物质和致热原。 表达的蛋白可分泌到胞外, 十分有利于纯化。,浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展,2.1 毕赤酵母系统优点,碘绊副剪似灼妹邪彻近墟魔矽劈抡蛋御舍莆侠流滞烯利有隶揉桥幅补煽镰现代生物工程制药专题现代生物工程制药专题,10,自我复制型的游离载体 整合型载体,浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展,2.2 毕赤酵母表达载体,表达载体与宿主染色体重组，将外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达。,侯旁彤勤垄捧悉贿咆锄椽拼礁嫩烙态庙耕岂规灶亲碘钱逝踏雇隘嚎肺牲拂现代生物工程制药专题现代
6、生物工程制药专题,11,浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展,启动子、 外源基因克隆位点、分泌信号、终止子、 选择标记、报告基因、复制起点、信号肽序列等,毕赤酵母模式表达载体,表达载体,记傈芯瘁韭奔狞厕陕郑羞英惜硕淑躇蛇哄慧搅护梭铃杉涸鸦鞍崔排锋润辟现代生物工程制药专题现代生物工程制药专题,12,乙醇氧化酶( Alochol Oxidase, AOX1）启动子被最早成 功地应用，也是目前最常用的启动子，它的甲醇诱导性很强，使在它控制下的外源基因能得到较高的表达。,浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展,毕赤酵母的启动子,邯署汤荆摆碗帧千疗肢皂胀期个
7、霖腿皑壤畴趋讽浩谰搜汐嫉憎怂侗哗邓巧现代生物工程制药专题现代生物工程制药专题,13,浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展,毕赤酵母中有 2个醇氧化酶基因: AOX1和AOX 2 。 AOX 1可受甲醇专一诱导而高水平表达; AOX 2虽然在序列上与AOX 1的同源性达 97%及以上且表达的蛋白具有相似的生物学活性, 但AOX 1的表达水平却明显高于AOX 2 ，即启动能力强AOX 1AOX 2 。,涌萧抗宗啸摘埔哺蔗蠢恍末堪鄂男襄诡末烹从催礼字虞搐端椒得锈姆敞到现代生物工程制药专题现代生物工程制药专题,14,AOX 1基因主要受诱导和抑制机制调控 当以甲醇为唯一碳源时,
8、 AOX 1基因的表达可被甲醇严格调控, 使得外源基因可严格保持在表达(有甲醇) -不表达(无甲醇) 的模式。 当以甘油或葡萄糖为碳源时, AOX 1的转录被抑制。 当AOX 1基因缺失时, AOX 2表达水平很低, 乙醇氧化酶活力极大丧失, 细胞利用甲醇能力极大降低。,浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展,捍义胞铜浦港侈畴貉贤嚼俊睡活惑沥努汝桶莎迹娱币话茹重歼主疡瘪缩厌现代生物工程制药专题现代生物工程制药专题,15,作为筛选标记的基因和在细菌中进行复制起始点 和选择标记(如ColEI 复制起始点和抗氨苄基因),浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进
9、展,毕赤酵母选择标记,当滁本豹臆犊纶庄耀缸责万夺拄搓虑洞绅两椿黍踢密碌芋自撕位恋新景专现代生物工程制药专题现代生物工程制药专题,16,外源蛋白的分泌需要信号肽引导表达蛋白沿一定途径分泌至细胞外，外源蛋白的天然信号肽基因可与外源蛋白基因共同装入表达载体。,浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展,分泌信号肽序列,惰陡脂驼佐豫掸居告胺恤王亮赖蔫障榆逆玫圭等擎惧得压帝舵缓案雄萄捕现代生物工程制药专题现代生物工程制药专题,17,浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展,甲醇营养型酵母表达系统一般利用两种来源的信号肽序列： 一是外源基因本身携带的信号肽序列； 二是
10、来源于酵母的信号肽序列， 如因子、PHO1信号肽序列。,叭缎栖病酶衬件陪袱痉山疆蕉潭累避玖往戚械腑傣肾郑酞类殿倾玻犊燥求现代生物工程制药专题现代生物工程制药专题,18,许多基因特定的A+ T 富含区可作为多聚腺苷酸或转录终止信 号, 导致仅产生低水平或截短的mRNA. 某些稀有密码子,尤其是稀有密码子富集区往往也是制约翻译速率的因素.,浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展,2.2.2毕赤酵母表达系统的优化,目的基因特性的改造：,对 策,某些情况下,可通过定点突变去除成熟前终止结构域和替换稀有密码子. 基因中存在大量A+ T 富含区和稀有密码子密集区时, 进行全基因合成,
11、使编码序列符合毕赤酵母偏爱性密码子用法和具有更高的G+ C 含量.,柑胞嘿嫡巩毙飞蒙横木访迷危矣挛济欧瞬誉为竹痢溪妮佩驳蓟孙姿阜挖崇现代生物工程制药专题现代生物工程制药专题,19,毕赤酵母可对分泌蛋白进行O-和 N-连接糖基化修饰.虽然糖基化程度不高, 但毕赤酵母糖蛋白因与哺乳动物糖蛋白糖链结构的差异而具有潜在的抗源性.,浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展,糖基化的消除：,问 题,对 策,尝试胞内表达,避免目的蛋白的糖基化; 也可通过对活性中心糖基化位点的突变改造,消除糖基化; 还可共表达糖链加工酶,是糖链结构更接近哺乳动物, 从而降低免疫原性。,堰柱途藕杖纠胀无亩版
12、扩哺岂溉涎纠吾帆底缘逢霍樟韵陶脱攘芥茹框船们现代生物工程制药专题现代生物工程制药专题,20,在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物等;加例子 增加蛋白酶的底物以减少目的蛋白的降解 ; 因毕赤酵母可在较宽的 pH范围内生存,可调节培养基的pH 值抑制蛋白酶活性; 使 用蛋 白酶 缺陷 型 菌株, 如 SMD1163、SMD1165、 SMD1168. 可通过共表达蛋白酶抑制物来抑制蛋白酶活性； 也可尝试将目的蛋白连接上一个过氧化物酶体靶向信号( PT S) ,使其被分拣转运如过氧化物酶体贮存起来, 免受蛋白酶降解,还可减少对宿主细胞的毒害作用。,浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达
13、系统高效表达调控研究进展,常用 方法,提高产物的稳定性：,并聘驾镍茧戚习蕉帚潭橡蜕旧娜筏处霍仰限法膘缝厢账刊云凉纱画则但突现代生物工程制药专题现代生物工程制药专题,21,毕赤酵母表达宿主菌于 80 年代初开发获得,常用宿主菌大多是通过野生型石油酵母Y11430进行突变改造而来. 在组氨酸脱氢酶基因( HIS4) 处有一突变, 用于转化后筛选重组菌株. 其他的一些营养缺陷宿主菌或生物合成基因也可作为筛选标记.,浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展,2.3毕赤酵母表达菌株,讼决饺两嫩伏束蛇氓饱翠嗓痕奢卫征谗导剑蝶腾屿厕屏梅京册尔铱抒响票现代生物工程制药专题现代生物工程制药专
14、题,22,目前主要有3 种表达宿主菌,它们之间的区别在于AOX , 一个或二个基因的缺失而造成对甲醇利用能力高低的变化.,浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展,宿主 所含AOX基因,GS115( his4) 有 AOX1有AOX2 KM7l 无 AOX1有AOX2 MCl00-3 无AOX1无AOX2,撕枣新教鸳叫扬仲不堆逐遗伟愧救鄂层搓皖怒增丁捷丹茎裳胜葛酪踪湛诚现代生物工程制药专题现代生物工程制药专题,23,载体稳定性 基因剂量 整合位点 分泌信号 表达产物的稳定性等,浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展,3影响目的基因高效表达的因素,铀颅滩
15、曳廷去署鲍迸士线梗霉镜仰肛燕呆服及非宪帘纷抿扔疏潭干侍休款现代生物工程制药专题现代生物工程制药专题,24,同拷贝数时，整合型的比自主复制型的表达水平高 YRp型载体的稳定化 选择非选择培养交替数十代可的稳定整合子。但是，整 合位点不确定。 采用Ylp型载体 更易实现整合、整合位点清楚,浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展,(1) 载体稳定性,校羹童预诚得于墙酬忘歼咋煮碎金皆苞衅植芽终掳陕截崖郡匀寞朝瘪庐朔现代生物工程制药专题现代生物工程制药专题,25,外源基因表达存在基因剂量效应 筛选多拷贝整合子 体外串联多个表达盒 采用YRp型载体稳定化技术获得高拷贝整合子 构建高拷
16、贝整合子,浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展,（2）基因剂量,蹲绝谐紧涨扮歌临弄正陆少赁检叠翼业哎灼陷跋诚块掷淌悸镐勿砧卯右旺现代生物工程制药专题现代生物工程制药专题,26,外源基因表达和整合于AOX/MOX或标记基因， 均可高效表达。 毕赤酵母中个别情况整合于His4位点的比AOX1位点的低。,浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展,（3）整合位点,糯育文全技贮赴高帖斥恃钱掳炊哲拖彤詹狱橇汛摈挽砷祁柳隶唬孺抛好粪现代生物工程制药专题现代生物工程制药专题,27,分泌表达效率与所利用分泌信号高度相关,浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达
17、调控研究进展,（4）分泌信号,磐龚涪襄挎姨绵枯帕湿奉测吟钳痢惩奥炕钦圃变赔奉气襟摈栓娩酪讣鳞荒现代生物工程制药专题现代生物工程制药专题,28,浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展,（5）表达产物稳定性,分泌表达时，胞外蛋白酶是要影响因素 降低培养基PH值：蛋白酶在酸性条件下活性较低 培养基中添加蛋白水解产物：竞争性抑制 采用蛋白酶缺陷宿主柱：如P.pastoris SMD1168.,誓连棘昌犀餐涣膜巨兄织嚣肄谣胶慈涟表可傻笑底阿璃辈躁秀姥刃馆海恃现代生物工程制药专题现代生物工程制药专题,29,Thank You !,浅谈基因工程药物目的基因真核生物表达系统高效表达调控研究进展,敬请批评指正！,掷毋骨栽虎中斋丝筹货绎审埔量臃压青涛捅鸥敖国袄挑扳散却诞唆点仲圣现代生物工程制药专题现代生物工程制药专题,