分子生物学实验任峰2011.ppt

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1、分子生物学实验任峰华中师范大学生命科学学院格涤奉缨毕衷湛诀叁互津酵乾驰竿寿撬籽醒慑咸社庐险砸窖饼寐倪乍秃以分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 实验目录实验实验一一植物基因组植物基因组DNADNA提取及纯化提取及纯化实验实验二二 PCR PCR克隆目的基因克隆目的基因实验实验三三 PCR PCR产物琼脂糖凝胶电泳产物琼脂糖凝胶电泳实验实验四四 PCR PCR产物凝胶回收产物凝胶回收实验实验五五目的基因片段与载体连接目的基因片段与载体连

2、接实验实验六六 E.coli DH5E.coli DH5和和 DE3 DE3感受态细胞制备感受态细胞制备实验实验七七连接产物转化转化大肠杆菌连接产物转化转化大肠杆菌实验实验八八阳性单菌落筛选阳性单菌落筛选实验实验九九重组质粒重组质粒DNADNA提取提取实验实验十十重组质粒及表达载体重组质粒及表达载体pETpET酶切分析与电泳酶切分析与电泳实验十一实验十一目的片段回收及与表达载体连接目的片段回收及与表达载体连接实验十二实验十二连接产物转化连接产物转化DH5,DH5,质粒提取质粒提取实验十三实验十三阳性质粒转化表达菌株阳性质粒转化表达菌株BL21BL21 实

3、验十四实验十四蛋白质的诱导表达及蛋白质样品制备蛋白质的诱导表达及蛋白质样品制备实验十五实验十五 SDS-PAGE SDS-PAGE检测诱导表达的蛋白质检测诱导表达的蛋白质新治巾椽菊候棺八接锑蛋期周爱钦仔千斋方俯蓝段哇殆氏统撇肋新你消澎分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 实验一实验一植物基因组植物基因组DNADNA提取提取基本原理 1. 基因组DNA 的提取通常用于构建基因组文库、 Southern 杂交及PCR 分离基因等。 2.不同生物（植物、动物、微

4、生物）的基因组DNA 的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。 3. 在提取某种特殊组织的DNA 时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA 大分子。尤其是组织中的多糖和酚类物质对随后的酶切、PCR 反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组 DNA 时, 应考虑除去多糖和酚类物质。其喊术亥价瑚哀永抹猫央智屎硷闲凰搪浴菌荤贯峪晕叔虏枫檬珠婉门巧喉分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任

5、峰 2 0 1 1 本实验是通过SDS法提取拟南芥基因组DNA。 4.核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸通常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分为DNA和RNA，在真核生物中，前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞质和核仁里。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。柬皋扼滓墟爷预帽茸举钾止慨合迈鹅捆泉骸瀑份枣琼毅究息策腻漾孩任傣分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 1.通过SDS提取拟南芥基因组DNA; 2.

6、为从拟南芥基因组DNA克隆目的基因作准备二实验目的三、仪器、材料和试剂仪器及耗材：研钵、微量移液器及吸头、EP 管、台式离心机。材料：拟南芥小苗试剂： DNA Extract Buffer (0.2M NaCl, 25mM EDTA, 0.5% SDS, pH 7.5); 70%乙醇；酚；氯仿；异丙醇;RNase 钎婉琅在拌肋朔手辉淡串丸企壕驼奏毗队场积腊熬吼糙烩艇钧鲜键辉簇宜分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 实验步骤 1. 取一定量的拟南

7、芥组织; 2. 加入600 l抽提缓冲液（0.2M NaCl, 25mM EDTA, 0.5% SDS, pH 7.5），室温下快速研磨; 3. 把抽提液从研钵中移至1.5 ml 离心管中，混匀; 4. 12,000 rpm, 离心10 min (RT)。取上清，加等体积酚/氯仿（1：1），上下颠倒混匀； 5. 12,000 rpm, 5min (RT) ，取上清，加等体积异丙醇，上下颠倒混匀； 6. 12,000 rpm, 10min (RT) ，弃上清，倒置于吸水纸上待壁上液体流尽后加入70%乙醇洗沉淀； 7. 12,000 rpm, 5 min (RT) ，弃上清，倒置于纸巾上待

8、其干燥； 8 加20 l ddH2O溶解沉淀; 吾瘁抄煤函铁等娩艳堡绪咀搞公替翌徽胖堂暖柑写桂剪米掏骑神接妹阅埔分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 9.在溶解DNA中加入3-5l RNase，37oC消化2-3h; 10.补充ddH2O至总体积400l，加入等体积的酚/氯仿，混匀； 11. 12000 rpm, 5min (RT)，取上清入新的EP管中，用等体积的氯仿再抽提一次,12000 rpm, 5min (RT) ； 12. 取上清，加入1/10体积的乙

9、酸钠和2倍体积的无水乙醇，并混匀，-20oC 放置10 min; 13. 12000 rpm, 10min ,4oC； 14.去上清，70乙醇洗沉淀,12000 rpm, 5min ,4oC ； 15.去上清，沉淀干燥后，加入 ddH2O溶解DNA 16. 通过分光光度计或电泳检测DNA的浓度和纯度。货手喻资打崖疮矫坷森蹦禾蔗贡影侯曰粤风滓歉锯坠捅斧种稳闽沙纱隧曲分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 实验二实验二 PCR PCR克隆目的基因克隆目的基因一实验

10、原理 PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应)是一种选择性体外扩增DNA 的方法.它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA 片段在94下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(56左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对; (3) 延伸(Extension):在TaqDNA 聚合酶合成DNA 的最适温度下,以目的 DNA 为模板进行合成. 由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA 扩增一倍,这些经合成产生的DNA 又可作为下一轮循环的模板,所以经 25-35 轮循环就可使DNA

11、扩增达待扩目的基因扩增放大几百万倍。龋琉过掇建抨闭逻枝珠丰参晓烃措议势滁阳盏站灌忆莹帖痕鸯硒助哺槐庞分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 PCR原理 FLASH演示搁窜孟学电洋缕颧篡化鸥镇莎绑厌臻厢陋雀鹊挡猫拄抡烬掂幽柞逊捉名顾分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 PCR技术发展 PCR是20世纪80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术

12、。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍。 PCR技术是生物科学领域中的一项革命性创举和里程碑。 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的 Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。 Mullis因发明了“聚合酶链式反应”而获得1993 年度诺贝尔化学奖。笑宠昭买哎奥勿隅颂硼乒移搜好够桶栅忽香深墓署据服礁散疗又丰踩邯儒分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物

13、学实验任峰 2 0 1 1 Mullis最初使用的 DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的 Klenow片段，其缺点是： Klenow酶不耐高温， 90会变性失活，每次循环都要重新加。引物链延伸反应在37下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。 Klenow这些缺点给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。 Taq DNA Polymerase 1988年Saiki 等从水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取耐高温的Taq DNA多聚酶(Taq

14、DNA Polymerase) ，此酶在 93下反应2h后其残留活性是原来的60%。缺点： Taq DNA Polymerase只有53 聚合酶活性，但没有3 5外切活性，无法消除突变和错配，碱基错误掺入率可达10-4/碱基/循环捡冷渠贮雁技牵饱己炳射驮碘酞纱迫渗判雇懒秽峰迟职散除槽池打酋或桔分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 Pfu DNA Polymerase Pfu DNA 聚合酶是已知保真度最高的聚合酶，来自于Pyrococcus furiosi

15、s 菌株，不仅具有掺入反应迅速及热稳定性高的优点，更是当前市场上所有 DNA聚合酶中掺入出错率最低的一种。优点：Pfu具有3 5校阅功能，其错配率分别仅为10-7。缺点：效率低，扩增片段较短吊蛇糜叙亦厅拧掠驮鳞醋舰淫柯有采秸潜纸双犯雌垣搏坤舵楞恼栖性锻致分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 Taq Plus DNA Polymerase 是Taq和Pfu DNA 聚合酶的混合物，与Taq DNA聚合酶相比，具有扩增长度增加（简单模板可有效扩增20kb

16、,复杂模板可有效扩增10kb), 保真度好的特点；与Pfu DNA 聚合酶相比，具有扩增速度快，反应效率高的优势。然牲阑巧依硫满寸踊振娇拜菠壤铆皱昏宪猫爽洛咬惠弛魔审末盎糊阅矢斟分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 PCR反应体系组成模板 5引物和3引物 4 种dNTP DNA 聚合酶 Mg2+ 反应缓冲液库柒锻侯穷磊蛮救闸腥茅赋拖鞠督麓袭俗财隶蓄烩似牙尚赁裂辜媚粥撮驶分子生物学实

17、验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 1. 模板 PCR 反应必须以DNA 为模板进行扩增, 模板DNA 可以是单链分子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以是环状分子就模板DNA 而言,影响PCR 的主要因素: 纯度: 蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应完整性: 模板降解会导致PCR扩增无产物浓度: 加量过多导致非特异性扩增增加境薪归驹畦冗闲牧剩肄异魏云斥凌眨丁较且绸鄂赤又谬亿癌寓乐琳匡宿错分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实

18、验任峰 2 0 1 1 2. 引物 PCR 反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR 成败的关键引物影响因素：特异性：长度适当、避免二级结构和二聚体完整性：避免反复冻融浓度：应适当,过高导致非特异性增加,过低则扩增产物太少奄碾发苇铡命台苛元扬宛串氰玻蹈断瞎鸭层叙阳钓氖崖伐兆押楚妹啡宙邹分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 引物设计原则 (1) 引物长度：约为16-30b (2) G+C含量： G+C含量通常为40%

19、-60%, 较短引物可粗略估计Tm4(G+C)+2(A+T). (3) 四种碱基随机分布，在3端不存在连续3 个G 或 C,因这样易导致错误引发。 (4) 在引物内及两引物之间, 尤其在3端应不存在二级结构。 (5) 引物5端对扩增特异性影响不大, 可在引物设计时加上限制酶位点。 (6)引物不与模板结合位点以外的序列互补选端龚淮积嘴舜券糟雪钾室否锈呐营铀惭号穿五火欢换亭霉遇扛睫耗贺琐分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 4 种 dNTP 浓度适当，避免反复冻

20、融 dNTP 原液配成10mM或者2.5mM分装,- 20oC贮存。一般反应中每种dNTP 的终浓度为20- 200M。当dNTP 终浓度大于50mM 时可抑制Taq DNA 聚合酶的活性. 4 种dNTP 的浓度应该相等,以减少合成中由于某种dNTP 的不足出现的错误掺入。臭址氮右晴钾碱果朴滞榆庚愁粉存驯蹦团害递饵十顷招澜墟纱疤她督怨鲤分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 Mg2+ 过高非特异性严重，过低无扩增产物 Mg2+浓度对DNA 聚合酶影响很大,它

21、可影响酶的活性,影响引物退火和解链温度, 影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+浓度范围为0.5-3mM。试剂公司通常会将Mg2+加入到DNA 聚合酶的反应缓冲液中： 10Reaction Buffer (including Mg2+) 10Reaction Buffer (without Mg2+) 债器绸绦烤谨枝考俞疙冤蓬净嘶羽汪骑甘耿涝强骄萤能求蓝藏诊儒齐渡扔分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 DNA 聚合酶 Taq DNA Poly

22、merase活性半衰期为95 40min, 97 5min. Taq DNA 聚合酶的酶活性单位定义为74下,30min,掺入10nmol/L dNTP 到核酸中所需的酶量。 Taq DNA 聚合酶的一个致命弱点是它的出错率,一般PCR 中出错率为 210-4 核苷酸/每轮循环, 100l PCR 反应中,1.5-2 单位的Taq DNA 聚合酶就足以进行30 轮循环. 反应结束后，如果需要利用这些产物进行下一步实验,需要预先灭活 Taq DNA 聚合酶, 灭活Taq DNA 聚合酶的方法有：(1) PCR 产物经酚:氯仿抽提,乙醇沉淀。 (2) 加入10mmol/L 的EDTA螯合Mg2+

23、。 (3) 99-100加热10min.目前已有直接纯化PCR 产物的Kit 可用。 Taq /Pfu /Taq Plus DNA Polymerase DNA 聚合酶单位定义：1个酶单位是指在以下分析条件下，于74，30min内使10mmol的 dNTP掺入酸不溶性成分所需的酶。不同公司提供的酶U的定义也不同。鞘粳漾搀亨肛投蘸夕刷列腰耘严萝勘添退湍陷杏帜纠衬匣蔼唾川扰杆粗儡分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 反应缓冲液各种DNA聚合酶都有自己特定反应

24、缓冲液； Taq DNA Polymerase反应缓冲液一般含： 10-50mM TrisCl (20下pH8.3-8.8)、 50mM KCl、适当浓度的Mg2+ 缓冲液 10 mmol/l Tris.Cl 提供适合反应的pH值（pH 8.4） 50 mmol/l KCl 促进引物退火 10 g/ml 明胶或血清白蛋白为Taq酶的保护剂互峪孟牌亥铬潘侵惶瘫然莲梯蚜堵哦纯晨怜咏挖厌看女陷遁腋阿乳葛刹滚分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 PCR反应主要参数：

25、1. 预变性：94C， 3-5min 2. 变性： 94C，30s-1min 3. 复性： 56 C，20s-2min 4. 延伸： 72 C，30s-3min 5. 总延伸：72 C， 10min 预变性和变性在第一轮循环前,在94下变性35min 非常重要,它可使模板DNA 完全解链。变性不完全,往往使PCR失败, 因为未变性完全的DNA双链会很快复性,减少DNA产量 . 一般变性温度与时间为94 1min。在变性温度下,双链 DNA 解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。狞蔚竞淡瞧俐羚托粹蒲隔倔花锑栅收盔肚量

26、涎蘑餐校邱变往射誊若占潘氛分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 退火引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成，引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度.实际使用的退火温度比扩增引物的Tm 值约低 5。通常退火温度和时间为55左右,1-2min。延伸延伸反应通常为72,接近于Taq DNA 聚合酶的最适反应温度 75.实际上。延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度。Taq DNA 聚合酶每分钟约可合成2kb 长的DNA。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10-

27、30min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物, 这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。万认蔷碴豫安阳埠鸟傻讳者挂显肯支行旺括诲墅弊萄绣艳厢旋孩怔亥难可分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 循环次数循环次数主要取决于DNA 浓度。一般而言25-30 轮循环已经足够。循环次数过多,会使PCR 产物中非特异性产物大量增加。实验目的 1.通过PCR从拟南芥基因组中扩增目的基因片段 2.学习PCR仪等仪器的使用材料：拟南芥基因组DNA 器材：移液器及吸头，P

28、CR 管， PCR仪，台式离心机。实验材料和器材缠靠但胰酋评肆浙苔替袒癸瑰八卸府瀑年滴卿厦戴励劫罢教限屉嗽橙城攘分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 所需试剂 10PCR 反应缓冲液 MgCl2 ：25mmol/L。 dNTP Mix:每种2.5mM 5和3引物：各10pmol/l （ 10mmol/L） Taq DNA 聚合酶 5U/l 无菌去离子水；饲惟寻品漫绽犊澜咳粮枣决忆迟勘膳丸涪斗勿专诅膛让惦班置

29、聋柴斧颤医分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 实验步骤 1. 在PCR管中依次混匀下列试剂(总体积 50l ) 5 l 10Buffer (Including MgCl2) 4l dNTP mix （各2.5 mM ） 1l 5上游引物（ 10M ） 1l 3下游引物（ 10M ）模板DNA (200 ng) 1U Taq DNA聚合酶补充ddH2 O 至50l 混匀后短暂离心（点离）。驹乔雌弹少侯握肺村沦碟聊焦志稗微贯辣洗烘黍泵蹿赶叔傲母度吹仇

30、令叠分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 2. 将PCR管放置到PCR仪中，盖好盖子 3. 用94oC预变性3-5分钟；94oC变性1分钟，58oC退火1 分钟, 72oC延伸2 分钟, 32个循环；最后一轮循环结束后, 于72oC下保温10 分钟， 4. 终止反应，从PCR仪取出PCR管，放置4oC存注意事项 1.PCR 非常灵敏, 尽可能避免污染。吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要互相污染试剂； 2.加试剂前, 应短促离心10 秒钟, 然后再打开管盖, 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面

31、； 3.应设含除模板DNA 所有其它成分的负对照。蟹千耽唆洛蘸鸳轰蔡始噬凝拧沧登伙亭朋爱据鲍谊俭磨致宵讹狡唾怒肢围分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 一、实验原理琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带实验三

32、实验三 PCR PCR产物琼脂糖凝胶电泳产物琼脂糖凝胶电泳联朋哪琐础河其宿芒申瓤术坍度鹊锁眷敬杰淖属野庆选阵生谬陋淋赌够霍分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 影响DNA 迁移速率因素 DNA分子泳动主要的因素分两方面： DNA分子特性和电泳条件。 1. DNA 的分子大小: 2. DNA 分子的构象 3. 琼脂糖浓度 4. 电源电压 5. 嵌入染料的存在 6. 离子强度影响娇疯就简氓翠滦减籍缅清履焦毋炉灸屈压权伤脐律

33、益树己波现假异廓藤览分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 琼脂糖是从琼脂中分离得到，由1,3连接的吡喃型b-D-半乳糖和1,4连接的3,6脱水吡喃型阿a-L-半乳糖组成，形成相对分子量为104105的长链。琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布，当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接，形成孔径结构，而随着琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径替低帅环茫鹅海馁瑞啦澈牵史快试吸粳态缺狗钻情佬金豁民返荷丢惺送弃分子生物学实

34、验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb) 0.3560 0.6120 0.70.810 0.90.57 1.20.96 1.50.23 12.00.12 琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围徊廉寂浊钳饭隧劝杂酿濒萎壹盅眷蒲痕玫脖捧学氦炳土幂女皱耘阑虎镣搽分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 核酸电泳缓冲液有三种 Tris-乙酸(TAE) 、Tris-硼酸(TBE)和 Tris-磷酸

35、(TPE). 轻唉狡冲摆包慑大欺变蝗蒲酞须砸旅姿亮纵癌齐盗跳吾镀马亮谋迪降墙淹分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 DNA电泳上样缓冲液 DNA Loading Buffer作用 1.螯合Mg2，防止电泳过程中DNA被降解，一般上样缓冲液中含10mM EDTA。 2. 增加样品密度以保证DNA沉入加样孔，一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。 3. 指示剂监测电泳的行进过程，一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿，它的速率约与

36、300bp的线状双链DNA相同。递庄婚则曲段怀详浆刃策蛰趾肝诫霉诌辅重科秘肝罚峪苏姨丝牢汤发迫澎分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 DNA电泳的标准分子量目前各厂商开发了各种类型的标准分子量，有广泛用于PCR产物鉴定的小分子Marker，也有常规用的大分子Marker 常用的DNA标准分子量电泳图迈嫩奏宴偷巴潦馒考祥预擒哄聚颗穴睬奔墓正同退鉴焙夜裙设尤剪竞酱玖分子生物学实验任

37、峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 二、实验目的 1 掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法 2 通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增的目的基因三、实验仪器、材料和试剂仪器及耗材：天平、电泳设备、台式离心机、称量纸、药勺、微量移液器及吸头、EP管、封口膜、三角瓶、微波炉、凝胶成像系统。材料： PCR产物试剂：琼脂糖，1TAE电泳缓冲液、溴化乙锭（EB）、6Loading buffer、无菌去离子水、 DNA Marker；盔坤腊连眷膘棘伎双铜巫录袍舟舆裳闻衬宁毅严灶台闯匹嵌碌请铆碾

38、讽贯分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 四、实验步骤 1. 1g 琼脂糖加入100ml 0.5TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。 2. 将制胶板放好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50）倒入，室温冷却凝固 3. 充分凝固后将胶板取出，小心垂直向上拔出梳子，置入电泳槽中，加0.5TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm。 4. 用移液器吸取3l 的6loading buffer于封口膜上，再加入5l DNA 样品，混匀后，小心加入点样孔。 5. 打开电源开关，一般红色为正极黑色为负极，调节电

39、压至3-5V/cm ，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min。 6. 在瓷盘中加入适量的水，再加入510l EB，将凝胶放入盘中2 3 分钟 7. 将凝胶置于凝胶成像仪内，再紫外灯下检测PCR产物的DNA条带兑宾冰锈工脊受撬年诧橙苍谢幽莽蘑憾什贝钝贵浊跃雕僻磺纹擎孟宠采副分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 一、实验原理 DNA沉淀、洗涤、融解、浓度测定和保存 DNA不溶于有机溶剂，可用乙醇或异丙醇来沉淀DNA 1 醇的沉淀，目的是使核酸从

40、体系中沉淀下来，从而实现核酸与其它杂质主要是盐分离。 2 标准的醇沉淀要求有一定的盐及某一比例的醇用量沉淀DNA用70%乙醇洗涤，除去其它盐和小分子物质。沉淀的DNA多使用水或者低浓度缓冲液溶解如弱碱性的 TE 溶解。核酸质量检测：电泳和紫外分光光度仪核酸在保存中的稳定性，与温度成反比，与浓度成正比。实验四实验四目的基因与载体连接目的基因与载体连接幕笆峙兰墒却鳞尚钉腥溪候渗淘磁旗熟咱坚影漱暇掀获邑恰褥咳碍校蓑抖分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1

41、目的基因与载体连接平末端连接 Taq DNA 聚合酶往往在PCR 产物3端加上多余的非模板依赖碱基,在用平末端连接克隆PCR 产物前,可用 Klenow 片段或T4 DNA 聚合酶处理补平末端。有些DNA聚合酶（pfu DNA 聚合酶）扩增的PCR产物为平端，可以直接用于平端连接粘性末端连接利用引物中附加在5端的限制酶位点,直接将PCR 产物经适当的限制酶切割后产生粘性末端,与载体连接,产生重组 DNA. 如果下游两个引物中含有两个不同的限制酶位点.经酶切后定向克隆到载体中。异跑獭吠掇坞践捕绅艘险夫老缺荫藐姓窿疫雕楷饮辟敞沧

42、筐份辆冗苟溃燃分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 T-载体连接 TaqDNA聚合酶能在平端双链DNA的3末端加一个非模板依赖碱基(A或T),所加碱基多为A。利用这一特点,可以经限制酶(如EcoRV) 切割载体,使其产生平末端,再利用Taq DNA聚合酶向载体双链DNA的3末端加上T ,使载体与PCR 产物末端互补并进行连接俘骤抹军填颠硕鸯恳醇螺潜喘坎流履闹夕衫渠溉得拈扰讶洋跃延快擅瞬烹分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分

43、子生物学实验任峰 2 0 1 1 pMD18-T Vector pMD18-T Vector是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体。用EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3端添加“T”而成。，本制品中的高效连接液Solution I可以在短时间内（约 30分钟）完成连接反应，大大方便了实验操作。捐淡陵乏斋长姆柿宁劲匙麓透暑舜迹恿卒晌咋归侦龟碑到意岩穗鉴坎戳炬分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 pMD18-T Vecto

44、r的结构啸动辊踏奔尉奢助敢伺劫访沙骡宠瞩坎妆审苑穷视文缔稚肿数看译膜粒栈分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 二、实验目的 1 通过乙醇沉淀DNA 2 通过T载体策略进行目的基因与载体的连接三、实验仪器、材料和试剂仪器及耗材：台式离心机、微量移液器及吸头、EP管、封口膜、水浴锅。材料： PCR产物试剂：无水乙醇，70%乙醇、3M NaAc（ pH5.2）、无菌去离子水；pMD18-T 襟蕴孰嚼人弦辙裙察娃夏骨想斤掘现

45、用阁锣氨窜执夫撼贩宗患铭尚蓑孪骤分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 四、实验步骤 1. 将PCR产物移入1.5 mLEP管，加去离子水至 400 L, 加入1/10倍体积的3M NaAc(40 L)和 2.5倍体积的无水乙醇，混匀，20放置10 min; 2. 12,000 rpm，4，离心10 min; 3. 去上清，将EP管倒置于吸水纸上； 4. 向EP管加入适量70乙醇，将DNA沉淀重悬； 5. 12,000 rpm，4，离心5 min; 6. 去上清，倒置吸水纸上，晾干，加入15 L去

46、离子水融DNA沉淀。识首骆心险女粒各怒虱赢贺腋果爱疼食汽膏褪临义土炮荤娇扬友枝痰蔑窟分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 7. 测定DNA的浓度 8. 沉淀的目的基因DNA与载体连接在PCR管依次加入下列反应成分(总体积10l) ： pMD18-T Vector 0.5 l Insert DNA 2.5 l (0.1 pmol0.3 pmol) dH2O up to 5l 加入5 l（等量）的 Solution I； 9. 16OC水浴中反应30分钟。养枚

47、鹿恬康撕辉蜒誊矢信巷激隘忠召钩禹壹担蔽遮蒂骨赋抿冬宜弟陨赫芋分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 一实验原理在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中 ,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能凭自己的能力进入细菌。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。实验五大肠杆菌感受态细胞制备憨豹胜扇幂缚卤虽胸

48、臻报联缴史裤挝钎渐骗伪脓垦砸作沾蛇全殉戍味厩标分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 感受态细胞制备方法化学法: CaCl2 处理后细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞 ; 物理法: 大肠杆菌暴露在电荷中时，其细胞膜会不稳定而诱导形成孔洞，于是DNA分子可由该孔进入细胞。渝颓艳多谚国索讽菱槐勃椅府口恳协必刹献导柄疡郁面矽相打剃腋羔河痪分子生物学实验任峰 2 0 1 1 分子生物学实验任峰 2 0 1 1 感受态细胞制备中应注意因素 1.细胞生长状态和密度不要用经过多次转接或储于的培养菌，最好从70或- 20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5菌株的OD600 为0.5 时,细胞密度在5107 个/ml 左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。 2. 试剂的质量所用的试剂,如CaCl2 等均需较高纯度，冰箱保存。 3.

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