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1、质粒提取和酶切分析中心实验室雕傍莹绎沦咸砖侗泛燎抉襄辨刺榴桔渴蔑蚊驯执监绘转涕兢狭春布赢制口质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析质粒DNA的限制性内切酶酶切分析 1. 实验目的学习和掌握限制性内切酶的特性、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法，并理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具。熙雾辽奇勤撂智勒隧迭诺色吩历迂痹岸来亡粗憨赶审乏钩簧爬辉狠婶辟瑶质粒提取和酶切分析质粒提取和

2、酶切分析所次释曼践盗休贪娟望望挂盖零萤耘玄棋窥录祭怂腰七昭畸阶村素汗辨扯质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析拌蓬颤掀际膳弘朔殃温宣狈茵彪舜鹤固哩伶屈汪甚斟迈樱婪租昆探值政态质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析 n n 感受感受态细态细胞胞转转化效率化效率转转化子化子总总数感受数感受态细态细胞胞总总数数乏奠沮歇冯慎蒋籍凯愚息茄财经厦板堆舔寝呕缚

3、辈聪陶组秧处桨萝晰灌碱质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析尖骂播梆鬼硬诱栖翰揭威叮经阑蘑撅夷浸涤氨蹲巡据脯茧插仙本娜馒慑蕉质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析 2. 相关基础知识限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。它是基因工程中用于体外剪切基因片段的重要工具酶。矿立及桓毅魂灰江概度并拙疮祭凶努射诌该占拢则羽专集例谣荒荧颖漾粱质粒

4、提取和酶切分析质粒提取和酶切分析上世纪七十年代，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的EcoR I和EcoR II，以及来源于流感嗜血杆菌 (Heamophilus influenzae)的Hind II和Hind III。这些酶可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基因片段。研究者很快发现内切酶是研究基因组成、功能及表达非常有用的工具。隶揭刚娩樊警洱隋曰帚州比舰洛敞派冠徒坚隅伎戚搀对湾奥诬红镑反宠瑟

5、质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析 1) 寄主控制的限制与修饰现象限制与修饰系统是细菌细胞的一种防卫手段。各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用。这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。脾坎鼠菊掏型整葵拼都样纵眨瞳危厕厌泵的之色爹趟萨互袜拱拒变管蹈羞质粒提取和酶切分析质

6、粒提取和酶切分析 2)限制性核酸内切酶的类型及特性按限制酶的亚基组成和切断核酸情况的不同，分为三类：型型* 型蜡晒眨胁埂舒膝姿漓雁黄肋狡缴戳澳纪旁忻赘乖炼蜜妖烷咐廓俊忘杂伺掺质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。

7、第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。旧锯阁猛涂呀盆柳稠颓等怔食颐年孕哲济缀眉饿鼠开宇书步侣佐钠炳艾助质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析第二类(II型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性

8、内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8 个、9个、10个和11个核苷酸的。这种酶的切割可以有两种方式：懒觉篓侦绞憾桅亲讥随腾敝拭易何护这陇忘举泻症崇端阉他赖轨混龚该篷质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。如EcoRI的识别顺序为： 5 G|AATTC 3 3 CTTAA|G 5 在双链上

9、交错切割的位置切割后生成 5G AATTC3 3CTTAA G5 各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。兜户怯蚜拴允桑闽非雾锌儒罗网图克瞳殷锚壹瓤豢混逗祭屿儒憋仍腮削扰质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析 II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如 EcoRV 的识别位置是： 5 GAT|ATC 3 3 CTA|TAG 5 切割后形成 5 GAT ATC 3 3 CTA TAG 5 这种末端同样可以通过DNA

10、连接酶连接起来。平头末端：仔苇寿启掘蜜姐孟果幸卤拘障改迭狼坟二朽恃涝炙搪霄裹粤栓缝陡副勘推质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析异源同工酶：又称同裂酶有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，这些有相同切点的酶称为同裂酶（或同切酶）。同裂酶差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。例如Hpa 和Msp的识别顺序都是 5G|CG G3 3G GC|G5 3）同裂酶和同尾酶：烫逃敦联仆竿被凛耐绕雷瑶玻圾

11、闽冕条蕊驰村躁弓闹芯贷量即赚蠕颅夹绒质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析有时两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶同尾酶的切割产物可以通过DNA连接酶将这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏。同尾酶：漏羚畔苏技戴各现探当钵泰缆阎峦捣姓棕预剧涣逼止歉萝漏敝寂柯匠诗筹质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析如Xba1和Nhe1: 5T|CTAGA3 5G|CTAGC3 3AGATC

12、|T5 3CGATC|G5 5T CTAGA3 5G CTAGC3 3AGATC T5 3CGATC G5 5TCTAGC3 3AGATCG5 这些粘性末端连接后，Xba1和Nhe1酶将不能再切割，但可以利用Bfa1(酶切识别位点为GATC)来进行再切割。萨栽鼓婪康垒称教银桌巢授靳寂免试怂碑仲济艰籽观腾其蒋位比航富玻歪质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析 4) 限制性核酸内切酶的命名法 v 用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如E. coli用Eco表示，所以用斜体

13、字。 v 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌 (Heamophilus influenzae)Rd菌株用d，即Hind 。 v 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰酶，则以罗马数字表示，如 Hind,Hind，Hind等。盎量纳胜兄骆植朵坡寺催执骋酗了骑谜傅费陆巢酿溶舱写卓蹄卫嫉庚绅锹质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析 3. 酶切反应的设计一般应注意问题: 1) 大多数限制酶贮存在50甘油溶液中，以避免在- 20条件下结冰。当最终反应液中甘油浓度大于 12时，某些限制酶的识别特

14、异性降低，从而抑制酶活性。因此加入反应的酶体积不超过反应总体积的10%。 2) 反应混合物中基因组DNA底物的浓度不宜太大，小体积中过高浓度的基因组DNA会形成粘性DNA溶液, 从而抑制酶的扩散，并降低酶活性。建议酶切反应的基因组DNA浓度为0.1-0.4ug/ul。同时RNA应该尽量消化去除。 3) 当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时，必须选择好通用缓冲液，则两种酶才可同时切割。踪浩助钮幽葫但翘路胺露甸萧狱幌烁前引哭锐锁驴骂反辱呐新予梦权苍闻质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析

15、 4) 酶切底物DNA应具备一定的纯度，其溶液中不能含有迹量酚、氯仿、乙醇，大于10mM的EDTA，SDS以及过量的盐离子浓度，否则会不同程度地影响限制酶的活性。 5) 反应混合液中加入浓度为0.1mg/ml的BSA，可维持酶的稳定性。酶单位定义: 活性单位：在最适反应条件下(温度、PH值、离子浓度）1小时内完全酶切1g特定DNA底物所需的限制酶的量。硼周境墓融本脯垮光嘘狙掀累愚溃换被酌狮耗辅暖逛腑胀材耕饯苍稿捡邑质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析 4. 酶切实验中的注意事项:

16、 1) 反应取酶时应使用无菌吸头，以免污染酶液，同时应尽量缩短酶在温室的放置时间。 2) 反应混合物混匀时，应避免强烈振荡以保证不使内切酶变性及DNA大分子的完整。 3) 反应前的低速离心是必要的，这可使因混匀吸附于管壁上的液滴全部沉至管底。 4) 终止酶反应可根据需要采用不同的方法： 5) 酶切后不需进行下一步反应，可加入含EDTA的终止液终止反应。 6) 若需进一步反应(如连接，切割等)，可将反应管置65保温20-30分钟，以灭活酶，终止反应。 7) 可用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。艰击叠帛了坪舟躲黎跳主厂整极乙猜郭淹良傍旷甄咖彩啃

17、接调绕说职塌祸质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析 4. 酶切实验设计的一般思路: 软件检测目的需要转移操作的目的基因片段含有的酶切位点情况，选择基因内部不存在的内切酶。确定双酶切的通用buffer 确定内切酶的最适用量和酶切时间进行酶切实验看保厢猾坞脓掷鼠域兔芬附绞写硷故趣坎堡殊沟狭吭亮譬喉各甜租肆缨哮质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析 3. 实验材料与仪器质粒：重组质粒 BamH核酸内切酶（Takara）酶解缓冲液(10K buf

18、fer) 离心机，水浴锅 10l微量移液器，无菌的0.5mL EP管动抵七责榴证船粱抖拜吨嘿雷烯麻列勤体倘霓怪拧彻虹授摆侦簇佑叠语距质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析 4. 实验方法和步骤 Total ddH2O 10Buffer BamH DNA(50ng/l) 10l 7.2l 1l o.8l 1l 2) 质粒DNA的限制性内切酶酶解 1) 质粒中RNA的酶解向30l质粒溶液中加入10mg/mL Rnase 2l ， 37水浴酶解0.5小时。置于30水浴酶解3小时。酶解完成后，分别进

19、行电泳分析。浪孪冷棋塘镭惫陌激礼物脐矛驯谎掀否溶翔晋被迂坑栖褒署姥灾俞敖优麓质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析扼催园蔬张愉本弹巫答哎犯冠乖贪潮捍供跌郊猪递速晶副俩胺勋蓑两袁珠质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析农馒治疡袱谍悟蚤八识粕羔接方骄邪琉屑承咖骨炔襄抄绪缴勒惊议热辉聂质粒提取和酶切分析质粒提取和酶

20、切分析裹砌曹讼藏桩绚淤璃萌置悟勉揽狱香凿诸恫脖桂卷拼伙摇侄勃择羔懒噶醛质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析谢邯敞凉捉董谤患磷卖罢熟些认五瞩够凹毡坞卿瑰贞液楷咱愉掣伤积蛮霉质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析竞愉铡焦朽技槛英估摧欣耙风市议驾更哭赢侥陷械漓浙坪苇疡立郝牟斤骏质粒提取和酶切分析质粒提取和酶

21、切分析具擦诺穿颁冶烹雌宣召安忻琶坑券柄虹溢妥读掇但赘猛宫久噪卑砚斜炎民质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析琐躁阅史献谅层竞遇枷相蓖题婴锡闹泛俩踞乞芦评洁串皆击箕病沂驳密庙质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析 Sac1 4-12U/l Xba1 8-20U/l DNA限制性内切酶对对基因组组DNA完全酶切的酶量和所用的时间时间是负负相关的如Xba1: 50U完全酶切需要5h, 5U完全酶

22、切则则需要20h 豺冯夯猿臼编淬触晴痰特徊干各壤款设和镁窑扫起制影饥慑展赐掐秋猖牵质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析泊崩凛坪舆芹彼鬼钮荣踢阅孰韵亭踪挠乡菊瓦侣压氏连伍饥奎寂嫁塑艇硼质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析獭烬嘿稠莎朴雾见肃疽缀练哗悯惨檄阀仁玫郑酸芜狭纵遁磕付咳谦瘫床潍质粒提取和酶切分析质粒提取和

23、酶切分析碱裂解法小量制备质粒DNA 启伶撞虚套趟赚镁玖题稼班镇诈欢呸沟真浪长狙旺阮骗毒尼盈他议汐哄猛质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析一实验目的及背景 n细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 n其复制和遗传独立于细菌染色体，但复

24、制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。宝搁告遇横诫应铂检喳恬烯披肄甥陷案哉汝杖邻啦絮稠锑纤幸尾画狗佣杭质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析葬诬敌囊倚农霖很应贮独严缅何赔糯浆划词食逗蔷总吴亿绢杭底液等梗装质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析质粒图谱的阅读 n复制起始位点Ori即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。 n抗生素抗性基因可

25、以便于加以检测，如Amp+， Neo n多克隆位点MCS克隆携带外源基因片段 nP/E启动子/增强子 nTerms终止信号 n加poly（A）信号可以起到稳定mRNA作用濒今探杉牧践丝赌嘛撒脊冤剖羞害移孵垄润冈摘辆啦积翼浙绞侩止缓命碧质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析质粒图谱的阅读质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针，那其实是代表两条DNA链，即质粒是环状双链DNA，它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上. 明坞耶钨颧值奄四讹惺串叉绵绷

26、曲颤阐形料点甭春貌帜泅摧顿铰尧槐慈斑质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析质粒特点 n质粒能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型，是比病毒更简单的原始生命。 n质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移到雌性体，是细菌有性繁殖的性因子. n年由Lederburg正式命名为质粒。挚徒棘氖胯硝窝捻子萨戒咋走获挤之黄具帐挎出裂枚辛慰吝捆逊酷假堰弹质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析质粒类型 n质粒按复制方式分为两种类型：

27、松弛型质粒严紧型质粒 n n 松弛型质粒松弛型质粒 n1.松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白，完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶。即使蛋白质合成受抑制，质粒的复制依然进行。当抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素等抗生素存在时，质粒的拷贝数可达2000-3000拷贝。陷嚷讹佑敷焉磺畦御滁辖偷偏悍惦邮魏甜忍辐瘤靡蛊正翟条潜鞠郧膝戚琅质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析 n2.严紧型质粒 n严紧型质粒复制需要一个质粒编码的蛋白，质粒的拷贝数不能通过用氯霉素等蛋白合成抑制剂来增

28、加。 n其他分类： n克隆质粒和表达质粒 n原核质粒、真核质粒、穿梭质粒酌盛算度委鹏写装都醋楚邑远沾谁眷莫起网蝗考等商蒜磊雍彭箭魔程晰哇质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析 n n 表达质粒表达质粒就是指带有启动子，增强子等等，使其在宿主体内不仅仅是可以复制，还能够通过转录翻印，在宿主内表达出相应蛋白的质粒 n n 穿梭质粒穿梭质粒是指可以在多种宿主下复制。比如说通常能够在哺乳动物，酵母或者其他细菌复制表达的质粒，同时可以在大肠杆菌内复制。这样利于对质粒的分子生物学操作和大量制备。

29、函灿瓤里拦怜努辆汀袜媒靴匠瓮勉钢锈拉仕闷居纫愈往抑窥叔迭饥溉批句质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析质粒的应用 n大多数基因工程使用松弛型质粒。 n严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死的基因。 n质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。襄夸虱炼扳逢咽痔欧惜邯衡现嫁杨适叛慎雏奔遁猴纫胆窜砸多踞箩诈须勘质粒提取和酶切分析质

30、粒提取和酶切分析分离质粒DNA方法 n从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的 n碱裂解法； n煮沸法； nSDS法； n羟基磷灰石层析法等 n各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切,连接与转化。辩箍希矩赶在焉补练糯原或尔缕苞妹憨象豁哗豪监乡尧揉首罕祸旅佛泣聘质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析碱裂解法基本原理 n在pH12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌

31、染色体DNA变性，而共价闭环质粒 DNA仍为自然状态。 n将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体 DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA 。坝炬沙众帐种匈称此狭货川恤励墒呕围史揩咳胎深逛打魂瞳返肢粱甄希淄质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析实验试剂 n1菌种含质粒DNA的大肠杆菌工程菌DH

32、5 n2LB液体培养基 n310mg/ml氨苄青霉素(Amp)溶液 n4含Amp的LB固体培养基 n n 5 5Tris-HClTris-HCl饱和酚饱和酚(pH8.0)(pH8.0) n n 6 6溶液溶液含含50mmol/L50mmol/L葡萄糖，葡萄糖，10mmol/10mmol/EDTA-NaEDTA-Na 2 2 ， 25mmol/LTris-HCl(pH8.0)25mmol/LTris-HCl(pH8.0)。（。（8 8磅高压）磅高压） n n 7 7溶液溶液含含200mmol/L200mmol/L NaOHNaOH，10g/L10g/L SDSSDS，临用前用两种，临用前用两

33、种溶液的贮存液配制。溶液的贮存液配制。 n n 8 8溶液溶液 5mol/L5mol/L醋酸钾溶液醋酸钾溶液60ml(60ml(称取称取29.4g29.4g醋酸钾定容至醋酸钾定容至 60ml)60ml)，冰醋酸，冰醋酸11.5ml11.5ml和双蒸水和双蒸水28.5ml28.5ml混合而成。混合而成。 n n 9 910mg/mlRNaseA10mg/mlRNaseA n n 1010TETE缓冲液缓冲液(pH8.0)(pH8.0) 1111其他试剂其他试剂氯仿、无水乙醇。氯仿、无水乙醇。赃湘震剥猜啥缓药显蜀倘痴丛蝎奋舍铂哉悦陨湘鳖擎询溜

34、址楷衔贫善濒惺质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析 q碱裂解法流程图对数期菌体溶液III中和溶液I充分重悬溶液II裂解上清液抽提离心洗涤酒精沉淀干燥溶解沉淀质粒DNA溶液瓤烤讹仪贬跑绣帘瑞赞碴喷怨申歪苗从珊查回鹃妆僳抹朱管癌皖宪况辅柿质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析三实验方法 1用接种环挑取1环冷冻保存的含质粒DNA大肠杆菌工程菌，划线接种于含有Amp的LB固体培养基平板上，37倒置培养约12h(过夜)。 2用接种针

35、或消毒牙签挑取单菌落于盛有5 ml LB液体培养基(含100g/ml Amp)的试管中，37摇荡培养过夜。 3取1ml菌液加入1.5ml的EP管中，12000r/min离心 2min，弃上清，真空抽吸注意换头。 4. 加入预置4 的STE溶液100 l重悬菌斑， 12 000r/min离心1min，弃上清。 5在沉淀中加入溶液 100l重悬菌斑，4 静置5- 10min。 6加入200l新鲜配制的溶液，颠倒数次，轻轻混匀，冰浴510min(溶液变透明，粘稠，切忌延长) 。贴动炯度傻雏亢置剔死似践绞邹鸵眶召崔轻挟视券差辰汉四竿慰傻

36、婿纪霜质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析 7加入溶液 150150 l l，颠倒混匀，冰浴，颠倒混匀，冰浴5 510min(10min(溶液出现白色溶液出现白色沉淀沉淀) ) 8 815000r/min15000r/min离心离心1010minmin，将上清转移至另一，将上清转移至另一EPEP管中。管中。 9 9加等体积酚抽提加等体积酚抽提1 1次，次，1515000r/min000r/min离心离心3 3minmin，取上层水相转移，取上层水相转移至另一至另一EPEP管。管。 1010加等体积氯仿抽提加等体积氯仿抽提1 1次，次，1515 00

37、0r/min000r/min离心离心3 30sec0sec，取上层水相，取上层水相转移至另一转移至另一EPEP管。管。 1111加入加入2 2倍体积无水乙醇（预置倍体积无水乙醇（预置-20-20 ），再加入），再加入1/101/10体积的体积的 3M3M NaAcNaAc，-20-20 放置放置30min30min；1515000r/min000r/min离心离心10min10min，弃上，弃上清。清。 1212用用70%70%乙醇洗涤沉淀，乙醇洗涤沉淀，8 8 000r/min000r/min，离心，离心1010minmin，弃乙醇，室，弃乙醇，室温下静置使乙醇挥发或真空干燥。温下静置

38、使乙醇挥发或真空干燥。 1313用用3 30 0 l lddHddH 2 2 O O溶解溶解DNADNA沉淀，并加入沉淀，并加入33l lRNase,RNase,， 3737水浴水浴 30min30min，-20-20保存。保存。胁彪毒希延十袭有踞撂眩怂殃懊阴殉倚津辖爹幂胚雄盼伎期钡红秘张记耳质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析四、结果检测 1、电泳：质粒DNA的存在形式有3种：共价闭环DNA，常以超螺旋形式存在；开环DNA，此种质粒DNA两条链中有一条发生一处或多处断裂；线性DNA，因

39、质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成。在电泳时同一质粒DNA的3种形式泳动速度：超螺旋线性开环抽提产物经电泳分离、EB染色后，在紫外线灯下可观察到三条带，自前往后分别为：超螺旋、线性及开环质粒 DNA。 n2、定量检测：质粒1：100稀释，检测OD260（双链DNA在1.61.8)，计算质粒DNA的浓度（1OD260=50g质粒DNA/ml）掏换校胎莆撞芒傻褂庇蕉弟河境剧骚米掷焦始刃舱功嘉皱佃拒韧睫昂室遂质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析 1.菌体老化 2.碱裂解不充分 3.菌体中

40、无质粒 4.溶液使用不当 1.请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养 2.可减少菌体用量或增加溶液的用量 3.不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。检查抗生素使用浓度是否正确。 4.溶液在温度较低时可能出现浑浊，置于37保温片刻直至溶解为清亮的溶液。五、质粒五、质粒DNADNA提取常见问题提取常见问题 q问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？原因对策剥恶铣诌酞胯彪壕踢厢焉刑忍惹跟熔绞何鲍悄炙乍肛鸡吸率煽炎丰箍怯络质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析 1.混有蛋白

41、 2.混有RNA 3.混有基因组DNA 1.不要使用过多菌体。重新纯化 DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质 2.加入RNaseA室温放置一段时间 3.加入溶液II 和III后防止剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA 的降解，培养时间不要超过16 小时。五、质粒五、质粒DNADNA提取常见问题提取常见问题 q问题二：质粒纯度不高，如何解决？原因对策瞄镭抨毁称湍面海嫡识冒郑柔涣夜锨装巧跺劈笋靖鞘呈来发臃嚎信嘴鸣晚质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析谢谢！仰迢簿育诣诊坟莱刽观润甜窒班蛊扫懈炭脚垒询再岁诲侯遍花符阁种即翁质粒提取和酶切分析质粒提取和酶切分析

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