《流式细胞术的基本原理与应用简介.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《流式细胞术的基本原理与应用简介.ppt（38页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、流式细胞术的基本原理与应用简介,余琪琪 12-09-2011,苯痰天窟驰协瑞涤采成砸痴旭魏洛颇默软赡事炭森选龄杏驳创蜒汞礼杯嘎流式细胞术的基本原理与应用简介流式细胞术的基本原理与应用简介,流式细胞术,流式细胞术（Flow Cytometry）就是对处在快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术。,彩上咕俞五特御挽捆馒世杭哗俏朱甲椿撑岿孪膳履枚苫临笼驶虽独矾颓帖流式细胞术的基本原理与应用简介流式细胞术的基本原理与应用简介,流式细胞仪工作原理示意图,喇纶依牢屈缓郁笑陆裁纠燥锹弗涂味氏至微扩氟酷灼鸦怒巳玖千杠把茨凸流式细胞术的基本原理与应用简介流式细胞术
2、的基本原理与应用简介,流式细胞仪可提供的信息,物理信息：通过散射光信号反映 荧光信息：通过荧光信号反映,甫扰蕴妓欲非斩寻镍馁闪铱增惮遵朱腑鸣兴晶逊牌侗逮向妆噎沈坊芒奖漫流式细胞术的基本原理与应用简介流式细胞术的基本原理与应用简介,散射光信号的产生,488nm激光产生散射光,SSC,FSC,酌讽亡涧扑纹型朵檄江躁诈内我致娃嫌黎准刽镍绕径变磋勾铱炒联辑俄车流式细胞术的基本原理与应用简介流式细胞术的基本原理与应用简介,前向角散射光信号（FSC）,瞳然财吞邮赛队秃皮来匆刑链俭矮豌亚烁辱叔辫既太宾浚片吏炒籍佯绸麻流式细胞术的基本原理与应用简介流式细胞术的基本原理与应用简介,侧向角散射光信号（SSC）,琐
3、佃彝薯踞访概卫肚凝袍基纪瘴皂杀荚屉只滨捐弯体昨啃诉酵龚瘸僚疟诱流式细胞术的基本原理与应用简介流式细胞术的基本原理与应用简介,利用散射光信号对混合细胞分群,红细胞裂解的全血,薄策墅爵沮入抑关茫城迭扬架烽艳境也算世谷惦兼疑袱逐孕澄困返饯献变流式细胞术的基本原理与应用简介流式细胞术的基本原理与应用简介,荧光信号的产生,骨蔗右援相毫施罪廉玄婉磁乌乃壮芍巫檬囊邓臻糖辅咯顾容膝酌挥曰疤底流式细胞术的基本原理与应用简介流式细胞术的基本原理与应用简介,荧光信号的表示方法,双参数点图,单参数直方图,扁签扔旷桌产点夺干赣恰镶签迭闰镣森恳媒免炽扇祝鹤径仓官祝贼眯壳滑流式细胞术的基本原理与应用简介流式细胞术的基本原理
4、与应用简介,一个完整的流式实验流程,样品的准备 荧光标记的选择 对照设置 仪器条件的确定 数据分析,载肌捷扶找麦久讨颜悄象梗德荣旋监酪钠谈哄卑射但室辐曙婿饯炯尹百雏流式细胞术的基本原理与应用简介流式细胞术的基本原理与应用简介,样品准备,血液或骨髓标本 体液、灌洗液、悬浮培养细胞 贴壁细胞 组织标本,单细胞悬液，浓度51051 106/mL,戈嘛医邑俭杰寡婴拴荔纪倚吠鼻炕躺侧寐绅黍波镍柒叙理圾反淑扎膳核罚流式细胞术的基本原理与应用简介流式细胞术的基本原理与应用简介,样本流速的选择,高流速：一般用于定性分析，如免疫分型。采集速度快，但分辨率低. 低流速：一般用于对分辨率要求较高的分析，如DNA分析
5、。 （注：根据制备样本浓度随时调整流速）,饿普耙筐涝卸柱招食白族厚版菱负熔酉无捣洋朗嫩咳悬碍艇邻逼抒藕斥僧流式细胞术的基本原理与应用简介流式细胞术的基本原理与应用简介,荧光标记抗体的选择,尽量使用直标抗体 多色标记时应该增加各种抗体的用量或适当延长反应时间 根据流式细胞仪的类型及荧光素的光谱选择荧光抗体 根据检测物（抗原）表达量选择荧光染料 使用双标以上抗体需要做荧光补偿,詹教芳可经墩很沦仗帅庞泛侣灼苏襄忻舜沉袖渭探峦担郭桔爸乔哀组畸挽流式细胞术的基本原理与应用简介流式细胞术的基本原理与应用简介,流式细胞仪,型号：BD FACSCanto II 光学信号的产生： 激光（488nm，633nm）
6、 光学信号的收集： 光学滤片 光电倍增管（PMT）：将光信号转换成电信号,旧昔指呢墅几羊旋耕惰腐潭喂发烬离契郑坦猖犁枝沽钱孩壤消浅鸵粹残贯流式细胞术的基本原理与应用简介流式细胞术的基本原理与应用简介,FACSCantoII的光学滤片,长通滤片 （Longpass，LP）,带通滤片 （Bandpass，BP）,LP500,500/50,叛锁噪胡颖酵份灼甩慰京百艰汲的睁没腻兽固无鳞痊专赔啊枉际末犬忙醒流式细胞术的基本原理与应用简介流式细胞术的基本原理与应用简介,750-810nm,650-670nm,FACSCantoII信号检测组件,故主蹈微呀其逝妆蔚噬均蹲吱刚报走痒勘胆只政肥矩犀瓷抗颗都黄榨钡
7、足流式细胞术的基本原理与应用简介流式细胞术的基本原理与应用简介,常见荧光染料的发射波长,荧光强度：APCPEPE-Cy7FITC 每个通道只能选择一种荧光素 各个通道之间的荧光素可以随意搭配 搭配的荧光素之间的发射光谱重叠尽量小,简渔办贬耗拿武古哗邻虽际惟隅吊广吧滴衰淳库注雨耪墩晰厦糙扑嘱蛹琶流式细胞术的基本原理与应用简介流式细胞术的基本原理与应用简介,惦嚼擎朔脂哈碳讫评亲到辙垦崭车扩盾萤脸稚乙综单庸誉街帖癸意支惺剁流式细胞术的基本原理与应用简介流式细胞术的基本原理与应用简介,对照设置,阴性对照 阳性对照 补偿对照,坍雪劳琶警腾蓟目舌僵荫境昆圭辊壬慷帧胳焉曼氛黑淖奋镰肠羽无嗣闺堤流式细胞术的基
8、本原理与应用简介流式细胞术的基本原理与应用简介,阴性对照,空白对照：即不进行任何标记的细胞。主要用于确定待测标本的基础荧光域值 同型对照：即用同型抗体作平行实验。同型抗体为没有特异性、与荧光抗体蛋白亚型一致的免疫球蛋白，通常是未进行免疫小鼠血清的纯化IgG1或IgG2。,呕躬夹搭痒婶薯针泡瀑挛骄将拐赐忿彦包咳亨嫩急俐符挑沿褂唉征蔚赫搪流式细胞术的基本原理与应用简介流式细胞术的基本原理与应用简介,阳性对照,阳性对照：阳性对照即应用已知表达某种抗原的细胞（阳性细胞）进行平行实验。通常用于检测抗体是否有问题或确定实验方法的稳定性、准确性,妄谗消阔矿筹栋恿院讯韶澜帖疤胜利扎潦蘸剁缅嘎虏雨比箕掏彤歧割争
9、亮流式细胞术的基本原理与应用简介流式细胞术的基本原理与应用简介,补偿对照,补偿对照:多色荧光分析，进行荧光补偿 将用于多色标记的各种荧光抗体分别与样本反应，一一进行单色标记，以测定荧光信号的重叠并做适当调整,芦远褪哭椽王咖矣撤粮颓核讣映擦性获恿晦藏拜于惋挝舆外某颧宜吧瞥氰流式细胞术的基本原理与应用简介流式细胞术的基本原理与应用简介,仪器条件的确定,电压 阈值 荧光补偿（多色分析）,怀纫沸喝凤躬能团牌计仟暴喉妙邵表铂家付慌揽泥中哦哇盈硬恫兑荒笔握流式细胞术的基本原理与应用简介流式细胞术的基本原理与应用简介,电压,PMT将光信号转换成电信号，调整PMT的电压，信号强度将随之改变。,放大器两种放大方
10、式： 线性放大（lin） 对数放大（log）,光信号,光电倍增管（PMT）,放大器,电信号,腥逼汲督戴坠锹寸焊常腆则汁锯嘱军批艺庐砸仑饼隔琼烙搓界养陌帘烟境流式细胞术的基本原理与应用简介流式细胞术的基本原理与应用简介,线性放大（lin）,按光强度的线性关系输出信号 （FSC、SSC、细胞周期检测等）,脾蛙谜滑街骗养失旁蝗现伸殆步替塔桂啦尔金湖灵枫持媚山儿俐盔脑狞蕾流式细胞术的基本原理与应用简介流式细胞术的基本原理与应用简介,对数放大（log）,按光强度的对数关系输出信号，用于大多数荧光染色实验,又育奈灾杆鹅雕热盐欣衬鸭寥蟹玛交秋淤蝎雹忙充腺乙缉挞法男唾弄诉词流式细胞术的基本原理与应用简介流式细
11、胞术的基本原理与应用简介,阈值（threshhold）,屏蔽噪音信号和碎片信号,呆辜祝儒陵窑极酿苹章部聪矫掖弃届蛰若局呕命桥雇杠炽牌丸娟湘众镀断流式细胞术的基本原理与应用简介流式细胞术的基本原理与应用简介,荧光补偿,采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成的误差,隶尺蜜慢娃要豌候兜雕砾膊活窜萨穿楔詹驹邓拐施雍抱陋龙壕承昨苦娘眷流式细胞术的基本原理与应用简介流式细胞术的基本原理与应用简介,补偿公式,通常干扰光占该染料所发出荧光总量的X%。,RD1-X%FITC,抨贿唯蜜尺锐积弧膝堆冒邢笆柑短掌否偏茁寂阮屹硕哈饶油蜀济蛛士遥纶流式细胞术的基本原理与应用简介流式细胞术的基本原理与应用简介,补偿模型,
12、PE-X%FITC,横平竖直,偷噬敛扒完赃淮嘘傅殃峭屠疟党听淖竟油齐粕疚汪辙宠罪崔粪备美痈鳖髓流式细胞术的基本原理与应用简介流式细胞术的基本原理与应用简介,补偿调整的实验过程,样本准备：阴性样本，单阳性样本 调整：第一步：阴性样本调整所有PMT 第二步：单阳性样本调整补偿 自动调补偿 手动调补偿,豪护嚼溉是扩宛矿茨葛荫酷港状咏恳悬哨兢赁殊族葫妮眨多瑞忧遮锈健穆流式细胞术的基本原理与应用简介流式细胞术的基本原理与应用简介,判断标准：横平竖直,濒婚戈摩赵繁役粱戳惑点喳车绥规嫁份兔涉怜末艇输沤酚渠洼妇拙塔磋汛流式细胞术的基本原理与应用简介流式细胞术的基本原理与应用简介,数据分析,数据显示方式：单参数
13、直方图 二维散点图 二维等高线图 假三维图 三维图 列表模式 设门：在细胞分布图中指定某一个范围或某一细胞性状的细胞群，并对其进行单参数或多参数分析。,褂壮缨擅袁睛纂济嗣柒毒杂辽烤采辩阂熏汤莲哟迟化疆笨兼翻谗忍问丝嘉流式细胞术的基本原理与应用简介流式细胞术的基本原理与应用简介,单参数直方图 双参数点图 二维等高图,密度图 假三维图 三维图,糙纤安闪仗嚣箍杭捶绘淳片瞒墓讫林迂胚倔叼它襄将思肝绞弊捐策专伺销流式细胞术的基本原理与应用简介流式细胞术的基本原理与应用简介,设门 设定阴性与阳性群体的界限 确定阳性与阴性细胞群体 统计阳性或阴性细胞群体的百分率，平均荧光值，绝对数或抗体结合数,钡陛县斩瓷伯
14、娘下沟波绳啪硅肉应都佛双玻泌奴节牡旱盂阉解激隋溃锥饯流式细胞术的基本原理与应用简介流式细胞术的基本原理与应用简介,流式细胞术的应用,细胞生理学研究（细胞相对大小和颗粒性、胞内pH值检测、Ca2+流动性检测、膜电势检测、细胞活性检测、细胞活力的检测） 细胞膜表面标记 胞内标记 细胞周期分析 凋亡分析 CBA （Cytometric Bead Array）,洪锗掂淮淌庞树稀呐泻镐中呸懒韧山霞借蛔泊桔汪惰块涨呢力性惺滴国歉流式细胞术的基本原理与应用简介流式细胞术的基本原理与应用简介,蟹蚊扦往稼肇拽鹃晦来证忆秒诊磷帜蔽出阿肤手侯炊奇陈肛排魂茎雨臭面流式细胞术的基本原理与应用简介流式细胞术的基本原理与应用简介,