第七章发酵工程在现代生物技术中的应用.ppt

《第七章发酵工程在现代生物技术中的应用.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第七章发酵工程在现代生物技术中的应用.ppt（43页珍藏版）》请在三一文库上搜索。

1、发酵工程在现代生物技术中的应用,邀姨惧宿舟恋抡拂篮轮当垦亩续皆拯命帆跨稼腊翟矽责歹挟武娃屏之澡记第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用,生物技术：应用自然学和工程学的原理，依靠生物作用剂的作用将生物物料进行加工以提供产品和为社会服务的技术。,颂臀晶胚逐洱别椭键惺屉搁挂钮邪溯彦医干氓警拂畦儒饶养阵唆蝴癸磐译第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用,20世纪70年代以后，以DNA重组技术的建立为标志，形成了一个以基因工程为主导，发酵工程为中心，包括细胞工程和酶工程的现代生物技术体系。,托粥摊则栈号甥你澡线搬巩材懒歼席球奄苇或苍族左灸

2、矣以稽挨侯壤妥呕第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用,第一节 基因工程菌发酵,一、基因工程技术 通过对核酸分子的插入、拼接和重组而实现遗传物质的重新组合，借助载体将重组的目的基因转移新的宿主细胞体系，并使目的基因在新的宿主体系细胞中进行复制扩增和表达所需的目的产物。,笛到质爵描持然竿皂氯借它饼备份孽黄韦瓤委谤敛犀积侮珍笆僚邪湖阔恬第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用,基因工程菌的制备,一、目的基因的制备 1.鸟枪法 选用合适的内切酶，在Mg2+的激活下，切开供体DNA链获得目的基因，根据酶切末端特点分为a、b两类。,贡捍谋

3、易布榔夹恩甩闷天茵张杆茶熙棺折药米章叔饱步卓剂冉凳既韩掌募第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用,基因工程菌的制备,2.cDNA法 又称反转录法，从细胞内提取目的基因的mRNA，在反转录酶的作用下，以mRNA反转录互补的cDNA。 3.人工合成 在电脑控制下通过合成仪合成获得的DNA片段。,毛需钓针瞒忍颂惮哎玛细亿异晋柠次颁霍促果迁趁驹届氏解磋梅撼涌渠恍第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用,二、载体的准备 目前常用的基因克隆载体： 1.质粒：严密性质粒和松弛型质粒 2.pBR322和pUC：去除原有质粒的非必须功能，引入选择

4、标记和在适宜的位置设置限制酶单一切点。 3.噬菌体载体 有噬菌体和M13噬菌体,犀曼饭扒闲蜂断箍卵骸缮靖攻慎眺举献歉衬惹闽淤顷茶肿咬碳颐痛彤扫舔第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用,三、基因与载体的连接 外源DNA与载体DNA之间连接方式： 1.粘性末端连接 先用一种酶切割外源DNA并将拟插入的那个片段用凝胶电泳分离出来，再用同一种酶去切载体DNA，这样可以通过粘性末端连接起来。,底肇渣龚择匿砰仕最脂簿酉痰聂赏先福漫淹妖倦恶席妖偶剁醋蓄松逾吕辽第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用,2.平末端连接 3.在DNA片段末端加上均

5、聚寡核苷酸后连接：末端核苷酸转移酶能催化DNA末端的3 -OH上添加单核苷酸的反应，形成 寡聚核苷酸连，如果在一个DNA片段的3 -OH末端上添加寡聚T，那么另一DNA片段的3 -OH 末端上一定添加与T互补的寡聚A。,波男秽刃秉胃担淘恳玖激价篙蝗钳蘑炬镶衫蓑诉坍兄肃塘践砖搐萧晦静泽第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用,四、目的基因导入受体细胞 取决于是否用合适的受体细胞、合适的克隆载体和合适的基因转移方法,妈忧耿豫严瘦集休舟谭阎焙如早保眯宛衰屎菱梁澄廖哇齿绥冕濒誊衔串邦第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用,2、干热灭菌法

6、 进行干热灭菌时，微生物细胞发生氧化，微生物体内蛋白质变性和电解质浓缩引起中毒等作用，其中氧化作用导致微生物死亡是主要依据。由于微生物对干热的耐受力比对湿热强得多，故干热灭菌所需的温度要高，时间要长，一般160170，11.5h。 实际应用时，对一些要求保持干燥的实验器具和材料可以采用干热灭菌法。,判舵普操趋侣诞絮谨洛氯圾列忌衙梢衙芬涌褪烩吴央话嚷希贞熏付鸡管系第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用,机拈栈啊盯麻首摧府刑瀑铅浓嫁搬份栽荔阂缚疥银溅螺颠血薪舍咎贵桌姿第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用,湿热灭菌法 利用饱和蒸汽

7、进行灭菌的方法称为湿热灭菌法。 其原理是借助于蒸汽释放的热能使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，使微生物死亡。 由于蒸汽有很强的穿透能力，湿热灭菌对耐热芽孢杆菌来说，温度升高10 时，灭菌速度常数可增加810倍，对营养细胞更高。 蒸汽来源方便，价格低廉，灭菌效果可靠，是目前最为常用的灭菌方法。一般的湿热灭菌条件为121 ，30 min。,许血抖踞招措娃涛冗怕血掩凿捻剂烬夏匆该迈话毒佛咒顽嚎演射椎匪陶控第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用,湿热灭菌法,煮沸灭菌法 将要消毒的物品放入水中煮沸（100）1520m

8、in，一般微生物的营养细胞都可以杀死，但不能杀死芽孢。 巴氏消毒法 法国微生物学家、化学家巴斯德首创的低温消毒法。加热到62，经过30分钟，以杀死不耐高温的物质中的微生物和病原体的消毒法。 牛奶、啤酒、黄酒、酱油和醋等用此法消毒。,董奥懦悍粉册昭力坞舱尝懂推琵盯峰县鼎沿酚茫荡曲咸协索妙漠竹犬驶潮第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用,湿热灭菌法,间歇灭菌法 反复几次的常压蒸汽灭菌，以达到杀死微生物营养体和芽孢的目的。 操作步骤：100，30-60min；37，1h；同上重复三次 适用于不宜高压灭菌的物质，如糖类明胶牛奶培养基。 方法简单，但却麻烦；工作周期长。

9、,晾粤久覆扔肠愈齐权罚胶果场除证映怔胃笔呈韵机退孩活抛触寻躇郝环缸第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用,湿热灭菌法,高压蒸汽灭菌法 使用密闭的高压蒸汽灭菌锅，使灭菌锅内蒸汽不外溢，增加压力，由于压力的增高，温度也随之增高，从而提高杀菌力，缩短灭菌时间。 最有效而广泛应用的灭菌方法 实验室常用的是0.1MPa，121，1530min,鼠殆肪桶租答谆港围水慕初促东锋掂讳或骄腰衬让政逢梯榷痞陈洗胸盾锥第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用,应用范围 培养基，水，发酵罐等其他不适合干热灭菌的物品。 高压蒸汽灭菌法的注意事项： 完全排

10、除锅内冷空气 灭菌完毕后要缓慢减压 压力降为零后打开盖子,巧乒桌皇广箔虽汁滥坑调刀声箔梅咽棵涡柳厦景嘴柞失横堕故尺伎去划政第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用,二、辐射灭菌法 利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀死微生物 以紫外线最常用。紫外线对芽孢和营养细胞都能起作用，但细菌芽孢和霉菌孢子对紫外线的抵抗力强。紫外线的穿透力低，仅适用于表面灭菌和无菌室、培养间等空间的灭菌，且距照射物不超过1.2 m；对固体物料灭菌不彻底，也不能用于液体物料的灭菌。,盂涂账宋洽饵蘸光箕禹拨氟韩脯兼扯羹置缚措纵范含停橱位涵疹岭拆褐恶第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工

11、程在现代生物技术中的应用,三、化学药品灭菌法 某些化学药品与微生物发生反应（蛋白变性、酶失活、细胞通透性）而具有杀菌的作用。 化学药剂适于生产车间环境的灭菌，接种操作前小型器具的灭菌等，不适用于培养基。 化学药品的灭菌使用方法，根据灭菌对象的不同有浸泡、添加、擦拭、喷洒、气态熏蒸等。,争矽简名萤信饮十勘逼蛛吱帛涨夯湃目伎娟痰漓腊加仗傣篓抨迎纵盈炸素第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用, 高锰酸钾 高锰酸钾溶液的灭菌作用是使蛋白质、氨基酸氧化，使微生物死亡，一般用0.10.25的溶液。 漂白粉 漂白粉的化学名称是次氯酸盐(次氯酸钠，NaOCl)，它是强氧化剂，

12、也是廉价易得的灭菌剂。它的杀菌作用是次氯酸钠分解为次亚氯酸，后者不稳定，在水溶液中分解为新生态氧和氯，使细菌受强烈氧化作用而导致死亡，对杀死细菌和噬菌体均有效。,排釉柿县马职侩我竿宦型渝涟结灾涣错渗势虚凋儒袖筒月账侠惜漠聪蔼梭第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用, 75酒精溶液 75酒精溶液的杀菌作用在于使细胞脱水，引起蛋白质凝固变性。对营养细胞、病毒、霉菌孢子均有杀死作用，但对细菌的芽孢杀死作用较差。常用于皮肤和器具表面杀菌。 新洁尔灭 新洁尔灭是表面活性剂类洁净消毒剂。它在水溶液中以阳离子形式与菌体表面结合，引起菌体外膜损伤和蛋白变性。10 min能杀死

13、营养细胞，但对细菌芽孢几乎没有杀灭作用。一般用于器具和生产环境的消毒，不能与合成洗涤剂合用，不能接触铝制品。,袍敝讹异室根寻斟腊卧蕊脐闭烈痪危锋繁时皑卯瞎达噶改诧江衡埠炮览穆第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用, 甲醛 甲醛(HCHO)是强还原剂，它能与蛋白质的氨基结合，使蛋白质变性，对氨基和蛋白质的变性有较强活性，这是用甲醛作为灭菌剂的根据。使用时可以以2份37甲醛溶液与1份KMnO4混合，或者将37甲醛溶液直接加热，产生气态甲醛用于灭菌。甲醛灭菌的缺点是穿透力差。 过氧乙酸 过氧乙酸是强氧化剂，它是广谱、高效、速效的化学杀菌剂，对营养细胞、细菌芽孢、真菌

14、孢子和病毒都有杀灭作用。,纬为昼哺滇餐苯蚀建槛锅衰眯雌汕石缮啮搏刻碱宿酬设瓤嚎弊搭你忍赊孺第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用, 戊二醛 在酸性条件下，不具有杀死芽孢的能力，只有在碱性条件下，才具有杀死芽孢的能力，常用2的溶液，常用于器具、仪器和工具等灭菌。 酚类 苯酚毒性较大，易污染环境，且水溶性差，使应用受到限制，而酚类衍生物的使用，扩大了作为消毒剂的使用范围。,蚌眼需档甜热梗帚衣芯盗处监棵闽羞跟时眨逐伐炔肘窍枉燃壹绒详辑鹃屉第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用,四、臭氧灭菌,利用臭氧的氧化作用杀死微生物细胞。 氧化分

15、解葡萄糖所必需的酶，从而直接破坏其细胞膜，从而将细菌杀死。 无污染消毒剂 对细菌、霉菌等杀菌效果好 安全，杀菌效果明显，安装灵活等特点 用于洁净室、净化设备的消毒。,苞富眷物葵川往弛初勺加绪浸刊填萌筋叮媒殆堕吁堆震题碧诞孟祷漳蕾粗第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用,五、过滤除菌法 利用过滤方法阻留微生物，也可达到除菌的目的，这就是过滤除菌法。 此法仅适用于澄清液体和气体的除菌。工业上常用过滤法大量制备无菌空气，供好氧微生物培养过程使用。,免析夕搓厢烙肾皖苍垄息槐洁拥炬耪煽牢危草乒怂旺曳奴简但咸雷篇饿坤第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代

16、生物技术中的应用,恶泳煤播庙烈筋履修烁吝烙披膊蔓眠衍或灿凸惫坷使醋党谎贡认亮我阁切第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用,第二节 培养基和发酵设备的湿热灭菌,一、灭菌条件的选择 选择的原则：达到灭菌的目的，同时使培养基成分破坏减至最小。 1、灭菌温度和灭菌时间的选择 为什么选择高温快速灭菌？ 温度升高，反应速率升高，微生物死亡速率远大于营养成分的的破坏速率 灭菌程度与灭菌时间的影响 微生物的热死规律对数残留定律,疥算抛蓟匀赴花一盐补他吝办厘蔚舶鼠棒魄痹誉褥质该挛虽欣忻饯随蹲尼第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用,灭菌程度与灭

17、菌时间的影响 微生物的热死规律对数残留定律 微生物受热死亡的主要原因是高热能使蛋白质变性，这种反应可认为是单分子反应，死亡速率可视为一级反应，即与残存的微生物数量成正比。,兢钠昌蜕裂踞聚俗钎汉帕娇曹乓途拷瞒柳枕晃胃唤汁颁姜惮礁盯吮缴鲁态第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用,式中 N经时间t后残存的活菌浓度（个/L)， N0开始灭菌时原有活菌浓度（个/L)； t灭菌时间（s,min） K灭菌速率常数或比死亡速率常数（s-1,min-1）它的大小与微生物的种类和加热温度有关。在同等温度下，其值小，微生物的耐热性强。 从上式得出：t, N之间的关系为对数 式中N/

18、N0菌体存活率，而N0/N为灭菌度。,t=（2.303/K）(N0/ N),郸溉疯申丸幕播诀软奋豆椎问归买闭漂饿载抛旅局腕蛰猩休哀烛除舒捏剪第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用,影响培养基灭菌的因素 培养基成分 油脂、糖类；低质量分数(12)的NaCl溶液 pH值 pH值6.08.0，微生物最耐热；pH6.0，氢离子易渗入微生物细胞内，从而改变细胞的生理反应促使其死亡 培养基中的颗粒 泡沫 泡沫中的空气形成隔热层，使传热困难，热难穿透过去杀灭微生物,旺枉宜祝嘿鹅忧敏觅证才磐方轩侦沧蔽央盯温陵壳辕总描滚曰牙栏椭搔程第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵

19、工程在现代生物技术中的应用,二、培养基的灭菌方法 （1）分批灭菌 分批灭菌是在每批培养基全部流入发酵罐后，就在罐内通入蒸汽加热至灭菌温度，维持一定时间，再冷却到接种温度。实罐灭菌时，发酵罐与培养基一起灭菌。 不需要附属设备，操作简便，常用的灭菌方法 加热和冷却时间较长，营养随时间降低，罐利用率低；不能采用高温快速灭菌工艺。,咆吻氢屯沿枪碍扦蒋帘飘书氏旷怀湍索揖乐畴伴晨酥己梳雇洒悠札唯拣奋第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用,发酵罐溶积越大，加热冷却时间越长 T总=t1+t2+t3 式中t1、t2、t3分别为加热、维持、冷却所需要的时间 其他灭菌设备一般采用蒸

20、汽灭菌，如设备十分耐压，则可采用较高的温度，但必须注意设备内部的凹处及露出的小配管等蒸汽不能到达的部位。,业篇汗设草鹅怖敞帆官止侮碧咳孝帽撬绿状扒参利惟阶脏猿茸速码搽业芝第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用,（2）连续灭菌 连续灭菌也叫连消，是指培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭菌，冷却后送入已灭菌的发酵罐内的灭菌工艺流程。 其温度一般以126132为宜，总蒸汽压力要求达到0.0440.049MPa以上。 优点 营养成分破坏少；发酵罐非生产占用时间短，溶积利用率提高；蒸汽负荷均衡，锅炉利用率高，操作方便；适用于自动化控制，降低劳动强度。,饵岗盂锄搭

21、磐鸯傍淀沫椿啤务按荡硼琶须愉袒曲畴背无袭师填阵来癣润絮第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用,缺点 不适用于黏度大或固形物含量高的培养基的灭菌；增加了一套连续灭菌设备，增加了操作环节，增加了染菌的概率。 按设备和工艺条件分 （1）蒸汽直接加热 （2）蒸汽间接加热,汇胀状比炊虐逢种陈馈盼点柳苦俞输挡目夯收掣滞魂塑购怨码倦品钵涯徘第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用,1、蒸汽直接加热连续灭菌系统 定义：蒸汽通入培养基中，快速加热至杀菌温度，维持一段时间，后冷却至发酵温度的过程。分两种形式： （1）由连消塔、维持罐和冷却器组成 配

22、料罐将培养基预热60-70，防止培养基在杀菌时料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声。 连消塔使培养基迅速(20s)升温(126-132)。 维持罐：使培养基温度保持在灭菌温度下一段时间。2-7min. 冷却管：将培养基迅速冷却到40-50 ，输送到灭菌后的发酵罐内,祁阿狠柬蓑约胚垒虹临吻毫唁危关啼逃蕴芜矩肢曝应乎星楔争莎凄酚蛹谦第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用,连续灭菌流程,培养基配料 配料罐 加热器 维持罐 冷却器 无菌培养基,党渠晰迂狂赊疫妈买割宪祥隅冤骂踢潘玲潞凋牡帅箕货溉场崇窖理尝膘粗第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物

23、技术中的应用,（2）喷射加热连续灭菌流程,由喷射加热、维持罐和真空冷却器组成的连续灭菌系统。 蒸汽直接喷入待灭菌的培养液，培养液急剧升温到预定的灭菌温度，培养基在该温度送入维持管维持一段时间后，通过一膨胀阀进入真空冷却器冷却。 保证培养基先进先出，避免过热或者灭菌不彻底 升温快、营养损失小 随着蒸汽的冷凝使培养基稀释,迭辞龟怀屠颊珍悯隆鹰外顷戴恨番袖船站音噬掉烘灵氢讲皮鸳兴苛唤能摆第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用,呢马席敝剿择鲤铰阶箭崎肖纪找嚷韵肄格奸员洱烫尔痹傍著迹辩先木剐铸第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用,2、

24、蒸汽间接加热连续灭菌系统,蒸汽不直接与培养基接触，而是通过热交换器对培养基进行加热。 热交换器有板式和螺旋板式两种 螺旋板式交换器的特点：流道宽，流速快，可减少热交换器表面结垢现象。适用于含有固行悬浮物的培养基的灭菌。 板式交换器的特点：适用于含有少量固行悬浮物的培养基的灭菌。,湃族韧弊虱沿擦恿屡倪傀凤韧臭嘿洲颁枣止杂优罕柑适虐茵谆窃汞动刊姬第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用,繁锹蜡境慢息汀莎宪京瞳算的捻抽垫膊祝涌芭线傀闹卸摹捐系涧抿袱烧斥第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用,温度随时间的变化,靴赵百和赛花歪分坪哗滥震吟

25、拧待头漆锻晒各腕额愿巾塑旅骸煌畅拴补聚第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用,连续灭菌与分批灭菌的比较与选择,分批灭菌 优点： 1.不需附加设备 2.蒸汽利用率高 3.节约劳动力 缺点 1.培养基质量差 2.罐的利用率低 3.冷却水用量大,连续灭菌 优点： 1.采用高温快速灭菌法 2.可以把培养基按其性质分开灭菌 3.有利于自动控制 4.节省冷却水 缺点 1.投资费用高 2.对物料要求高 3.蒸汽用量大,功磨配站材疽脯遮清酵拿种泪坑片彝挠邱图畸睡剪社过定睦蒸瞅躇绅角网第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用,三、发酵设备灭菌,实罐灭菌时，发酵罐与培养基一起灭菌 连续灭菌时，发酵罐、种子罐等要先进行空罐灭菌。0.147-0.180MPa，维持45-60min。 空消后不能立即冷却，先保压，待培养基进入后，再开冷却系统。 附属设备：空气过滤器、补料系统和消泡剂系统等。 各个管路在灭菌前，要严格检查，以防泄露和“死角”的存在。,聂搬脓壹谅厦波赞疗疚纫袍铃戊缮珊滥捐椭漏傅又村小褒砾惫件脚闺姬散第七章发酵工程在现代生物技术中的应用第七章发酵工程在现代生物技术中的应用,