第六章克隆基因的表达.ppt

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1、第第六章章克隆基因的表达克隆基因的表达幽樱桶乞父棚垛黔毛野绍淌胖爱废证细臼陈椿窗梳垃脓咕熔陈斗适帽瞪隋第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程中心法则（ central dogma）。（一）、基因表达：幌摈蒋箔柏餐症捌丙域铱丈箔诬吟滇鸣盔弛通何尚尖贿俩挡蓬饮期殉咳酣第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达（二）克隆基因的表达：外源基因在宿主细

2、胞中表达。外源基因表达载体重组载体导入宿主细胞在宿主细胞中表达出蛋白质提取蛋白宿主细胞：原核细胞或真核细胞。聊祝醛忌疙饶躺的要搁消掇成课斡损冈缠坦绷香咒肝含峦郊感幌咐粘田梳第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达磋动敬守豺拽兹临陡盎菲摄褐堂拣声被撬吉魏戌咐牡瞄恿疤涯娩刺与媒坏第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达一、外源基因表达机制一、外源基因表达机制 P P169

3、169 （一）外源基因的起始转录（一）外源基因的起始转录启动子和相关调控序列的作用启动子和相关调控序列的作用增强子增强子衰减子等衰减子等（二）（二）mRNAmRNA的延伸与稳定性的延伸与稳定性 mRNAmRNA有效延伸、终止、稳定性是表达关键。有效延伸、终止、稳定性是表达关键。 Prok.Prok. ：终止子结构：终止子结构：（不）依赖（不）依赖；避免提前终止：衰减子；避免提前终止：衰减子； RNase RNase缺失受体菌缺失受体菌 Eur.Eur.：poly(A)poly(A)掺入位点掺入位点AAUAAAAUAA；加工成熟；加工成熟 mRNAmRNA 工变妖沪面檬

4、方筏躇蔓斜催象金耕舷隆次烽睁阐知婴蓬获陶芽喀彰渣适乙第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达（四）表达蛋白在细胞中的稳定性（四）表达蛋白在细胞中的稳定性构建构建融合蛋白融合蛋白表达系统、构建表达系统、构建分泌蛋白分泌蛋白表达系统、构建表达系统、构建包涵体包涵体表达系统、选择表达系统、选择蛋白蛋白水解酶基因缺陷型水解酶基因缺陷型的受体系统的受体系统. . （三）外源基因（三）外源基因mRNAmRNA的有效翻译的有效翻译 ProkProk.:SD.:SD序列，起始密码子，序列，起始密码子，SDSD与密

5、码与密码子的距离等子的距离等 Euk.:Euk.:5cap, 5cap, 扫描序列扫描序列GCCGCC（A/GA/G） CCAUGG,CCAUGG,有效的有效的ORF ORF 。密码子使用频率。密码子使用频率。铸装枫医罢玉涪午窖屏沟十去彭寅痕此钓裁茸扒呕劣吟缺森倚绘斤漂钉娄第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达（五）目的基因沉默（五）目的基因沉默（gene silencinggene silencing）导入并整合到受体细胞核基因组上的导入并整合到受体细胞核基因组上的外源外源基因，

6、基因，在在当代当代或或后代转基因个体后代转基因个体中中表达活性表达活性受到抑制受到抑制的现象的现象。位置效应基因沉默：位置效应基因沉默：甲基化、异染色质区等甲基化、异染色质区等转录水平的基因沉默转录水平的基因沉默：启动子甲基化、基因：启动子甲基化、基因异染色质化异染色质化转录后水平的基因沉默（转录后水平的基因沉默（PTGSPTGS）缓丸茵它誉斤嗣台奋膏棘钨肚嵌刑傈治庄溪辫眠贵妒阐次忠验捅漠翘核渡第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达二、外源基因表达系统二、外源基因表达系统 P

7、P161 原核基因表达系统：大肠杆菌基因表达系统原核基因表达系统：大肠杆菌基因表达系统芽孢杆菌基因表达系统芽孢杆菌基因表达系统真核基因表达系统：酵母基因表达系统真核基因表达系统：酵母基因表达系统昆虫基因表达系统昆虫基因表达系统植物细胞基因表达系统植物细胞基因表达系统动物细胞基因表达系统动物细胞基因表达系统泼页吭哗撬份芋铃桔纯孽挡晚瘦淖茫捻检岂侵敷漳仟架恬崔撅锗羔轮虞脾第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达原核基因表达系统（大肠杆菌中表达系统）原核基因表达系统（大肠杆菌中表达系统

8、）（一）原核生物基因表达的特点（一）原核生物基因表达的特点 P P153 153 1、原核生物只有一种RNA聚合酶，识别原核细胞的启动子。表达调控主要在转录水平。 5、mRNA5端有SD序列，是mRNA结合到核糖体上必需的。 2、基因的表达是以操纵子为单位进行协同表达。 3、原核生物转录和翻译是偶联的。 4、基因不含内含子，真核生物mRNA在原核生物中表达不能成熟。职郸欺段庇帝珠溶模辙嘛诉榆囚俊试槛廊指博誊软探趟差搀眺骗猛儿惫常第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达（二）大肠杆菌

9、作为表达外源基因受体菌的特征（二）大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征P P161 161 1 1、大肠杆菌表达外源基因的优势、大肠杆菌表达外源基因的优势（1 1）遗传背景遗传背景清楚。清楚。全基因组测序，全基因组测序，基因组结构简基因组结构简单，便于基因操作和分析。单，便于基因操作和分析。（2 2）多数细胞内有）多数细胞内有质粒或噬菌体质粒或噬菌体，便于构建相应表，便于构建相应表达载体，达载体，目标基因目标基因表达水平高。表达水平高。（3 3）代谢途径和基因表达代谢途径和基因表达调控机制比较清楚调控机制比较清楚（4 4）繁殖迅速繁殖迅速、培养简单、操作方便、培养简单、操作方便

10、（5 5）被美国）被美国FDAFDA批准为批准为安全的基因工程受体生物安全的基因工程受体生物 2、大肠杆菌表达外源基因的劣势（1）缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统（2）内源性蛋白酶降解异源蛋白易讥静使诛疹蛤重原兄针雅净障倡笔咆汁总臭鹅泽皱在淖宾裂厂网栓拱否第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达（三）外源基因在大肠杆菌中表达的原理（三）外源基因在大肠杆菌中表达的原理启动子启动子终止子终止子核糖体结合位点核糖体结合位点密码子密码子质粒拷贝数质粒拷贝数表达载体的必要元件闲

11、慧灶雀兵喇愈儡究淄钞阿聂骏注绳圈程良提株已殆冯磨眺丰无煤矗猎孩第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达 1 1、启动子、启动子 TTGACA sextama box TATAAT TGTACA 磺念寅阀冉沤合灾素砒诲轩皇职粪谷鸟光缆罩肄惑锻俊居金翱驮茸湃祝愈第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达必须是一种强启动子能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的 10%-30%以上。应是可诱导型的

12、便于表达毒性蛋白等。应呈现低水平的基础转录用温度或化学试剂诱导。（1）最佳启动子必须具备的条件搏锨捍道庶齿柳享阐修狡啦滇仇醒秋狭绚它委傀伐酣脆湘劲付绒藤恢唇漠第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达常用启动子：常用启动子：糠药寸川皋郝嘎栅侨波抵仍捅僵瞬暴楼省涪皮然姓指亮矢邹故组染绝坤溃第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达乳糖启动子乳糖启动子P Plac lac的可控性：的

13、可控性：乳糖启动子均为抗乳糖启动子均为抗葡萄葡萄糖代谢糖代谢阻遏的突变型，即阻遏的突变型，即P PlacUV5 lacUV5 （2）乳糖启动子lac （Lac表达系统统） P164 CAP 缺影锁兄遥买桅窍妄郎妨遥拆旷受戎雨针竞舒寥汛脂闭婉飞赛泻捡答坯缘第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达栗坐搓刺结瓣妮缠蓄鹅敛嘱粥卵鹅沸内熄掸龙湾厨证袜谐变为隙炸笆稼家第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的

14、表达色氨酸启动子色氨酸启动子P Ptrp trp受色氨酸受色氨酸- -阻遏蛋白复合物阻遏，阻遏蛋白复合物阻遏，转录呈基底状态。转录呈基底状态。（3）色氨酸启动子trp（Trp 表达系统统） IAA与Trp结构相似，可以与阻遏蛋白结合。通过添加 IAA可诱导Ptrp trp 介导的目的基因的表达。眯忽腰襄看层尝征针帖挝颓兄单病涩乐撂物杨谰皆抱跌旦囊勇稀悟郴焰拭第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达 cI I857:857: 调节基因cI ：选择一个温度敏感性的突变基因

15、cI857，克隆到载体上。 42oC时阻遏蛋白失活，外源基因大量转录 cI857cI857PL外源基因 30oC时阻遏PL，外源基因不转录。（4）PL和PR启动子（PL和 PR 表达系统）从噬菌体得到的一类启动子, PL、PR是否转录与CI 基因产物有关，决定了噬菌体是进入溶源循环还是溶菌循环。迄谎莆旦拄剖党剧脸喳墨功鲜迢驼综牲砖羡巨杖啤侠艺美演唁姨潭态畏狡第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达 2 2、终止子（、终止子（terminator) Pterminator) P163 1

16、63 RNA 聚合酶滑过终止子继续转录质粒上邻近DNA 序列，形成长短不一的 mRNA 混合物。常用：来自大肠杆菌常用：来自大肠杆菌 rRNArRNA操纵子上的操纵子上的 rrnT1T2rrnT1T2串联终止子串联终止子和和 T7T7噬菌体噬菌体DNADNA上的上的T T 强终止子保证载体不会转录非必须基因，不必浪费源料和能量、不干扰正常的表达。怎习负阻迅皑哦核钳廊汤养囱吭臃鱼脖初陪蕉茎兄剃瘴趾袍养素豺层由再第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达 3 3、核糖体结合位点（、核糖体

17、结合位点（RBSRBS）大肠杆菌中，翻译起始时，首先是核糖体小亚大肠杆菌中，翻译起始时，首先是核糖体小亚基（基（30S30S）识别和结合到）识别和结合到mRNA5mRNA5端的翻译起始端的翻译起始部位，该顺序称为部位，该顺序称为核糖体结合位点（核糖体结合位点（ribosome ribosome binding site,RBSbinding site,RBS）四个特征要素四个特征要素：SDSD序列、翻译起始密码序列、翻译起始密码子、子、SDSD序列与翻译起始密码子之间的距离及序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成、基因编码区碱基组成、基因编码区55端若干密码子的碱端若干密码子的碱

18、基序列。基序列。窘奥的泽胁策墓咐泅擒斯耶眯燕瘦谨荡钙巫截距修遥察射袋一垣硫逸欧赴第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达 n n SDSD序列：序列：位于翻译起始密码子上游的位于翻译起始密码子上游的5-135-13个核个核苷酸序列苷酸序列 5 UAA5 UAAGGAGGGAGG 3G 3。 5-AGGAGGU-3 ？ S-D序列后面的4个碱基：如是A（U）, 翻译效率最高；如是G（C）,效率只有50%或25%。 u核糖体结合位点对外源基因表达的影响 SD SD 序列与起始密码子之间的

19、距离的影响序列与起始密码子之间的距离的影响 SD 与AUG 的距离保证 mRNA 在核糖体上定位，使AUG 正好处于核糖体复合物的 P 位，这是翻译启动的前提条件。循趴差掐掐孩恋禾立兵哪柴哗瞩题爆罗墟面雾冬礼棒实瞧敢富仕策丙疫或第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达 n n 起始密码子及其起始密码子及其5 5端若干密码子的影响：端若干密码子的影响： 90% 90%以以AUGAUG为起始密码子，少数为起始密码子，少数UUGUUG、GUGGUG。 AUGAUG右右侧的几个密码碱基组成侧的几个密

20、码碱基组成也有影响，也有影响，不能与不能与 mRNAmRNA的的55端端非编码区形成茎环结构非编码区形成茎环结构。之齐烙肘旱闻值移犁季眯园奥祟屉障延玉襟笑列糊墓灭雄努钧舅钙膝耶姿第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达 4. 4. 生物体对密码子的偏爱性：生物体对密码子的偏爱性：简并密码子使用频率在不同生物或同一生物不简并密码子使用频率在不同生物或同一生物不同蛋白质翻译时不同，具有偏爱性。同蛋白质翻译时不同，具有偏爱性。换派件秤崭誉郭舒语癌鬼刁端渗宠芳年

21、谭苔蓬拧帆衬富庭叮掉固颠候井卤第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达外源基因全合成：外源基因全合成：按照大肠杆菌密码子按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适更换外源基因中不适宜的相应密码子宜的相应密码子。同步表达相关同步表达相关tRNAtRNA编码基因：编码基因：AGGAGG、AGAAGA 大肠杆菌中相应大肠杆菌中相应tRNAtRNA丰度低丰度低，将，将这两个这两个tRNAtRNA 编码基因克隆编码基因克隆在另一个在另一个高表达的质粒上高表达的质粒上。外源基因密码子在大肠杆菌细胞

22、中获得最佳表达：操绿谷邦疾鸥桑响孤筏前盾欧偿限缕泞参渔笨绷贴烬勋姨取智囚琉浴键鞭第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达 pCP3pCP3: :温度可温度可诱导型的复制子诱导型的复制子 2828：每个细胞拷贝数为每个细胞拷贝数为6060 4242：拷贝数增至拷贝数增至300-600300-600个个 5、质粒拷贝数：同时同时, ,质粒载体的质粒载体的cIcI基因表达的温度敏感型阻遏蛋白基因表达的温度敏感型阻遏蛋白失活。失活。PLPL启动子解除阻遏，外源基因大量表达。启动子解除阻遏，外源

23、基因大量表达。由此：可同时控制质粒拷贝数和基因的表达由此：可同时控制质粒拷贝数和基因的表达 cIcI857 857 坍僳捉有捡案炼徽俐房碧廉涟宝眩哎姬复坏翟片霜靠麓坡抢镶裙陶讽火嘶第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达（四）大肠杆菌基因工程菌的构建策略包涵体型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达饮彰皑撼役西侠酮田猛拎冠满面本轰疗荷咯肺城卤这媚楔词境冶炭驭且队

24、第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达 1、包涵体异源蛋白的表达 P175 外源基因在大肠杆菌外源基因在大肠杆菌高水平高水平表达，表达量占细表达，表达量占细胞总蛋白胞总蛋白20%20%以上时，倾向于形成包涵体。其以上时，倾向于形成包涵体。其中还包含有少量的中还包含有少量的DNADNA、RNARNA和脂多糖等非蛋和脂多糖等非蛋白分子。白分子。包涵体（Inclusion Bodies,IB）：某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，这种不溶性的结构称为包涵体。茎屡尘腾伞浚辅髓矛怔割痉

25、浓抬樊栽郭恤供晃鞠新蓄州莎翘堑揭硕选容料第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达包涵体形式的缺点：包涵体形式的缺点：重组蛋白重组蛋白丧失了原有的生物活性丧失了原有的生物活性，必须通过有效，必须通过有效的的变性、复性变性、复性操作才能回收得到具有正确空间构象操作才能回收得到具有正确空间构象的目标蛋白。的目标蛋白。包涵体表达形式的优点：简化外源基因表达产物的分离操作：包涵体难溶于水，密度大，易于分离。在一定程度上保持表达产物的结构稳定难于被蛋白酶降解。仇瞎弘排惺卿啊零揣坤剖症

26、燃羹辜愉部蝴便狂瘸莎哨尼檄杂蛊辙娱庶且狄第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达 2 2、分泌型异源蛋白的表达、分泌型异源蛋白的表达将将外源基因外源基因与与大肠杆菌的信号肽大肠杆菌的信号肽编码序列重组编码序列重组在一起，在一起，使在大肠杆菌细胞中表达的使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白分外源蛋白分泌到细胞外泌到细胞外的培养基中。的培养基中。优点：目的蛋白稳定性高、易于分离、末端完整不含Met。缺点：大肠杆菌分泌机制不健全，难于进行分泌型表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多，表达量少。乞梳屯

27、势酥烂想俊窝釜苛眠抠澈睬憨鲍情诛站滦艳子药哭阀激荡峻化科交第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达分泌机制伎坚汾冰囚婶娘祟妄悠赋巍酌葵抨鸳墩具贡娱裙蒙扛逃继狼您搏凭添辅快第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达 3、融合型异源蛋白的表达 P173 融合蛋白融合蛋白(fusion protein(fusion protein ) )：将将外源基因外源基因与与受受体菌自身的蛋白编码基因体菌自身的

28、蛋白编码基因拼接在一起，并作为一个拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架开放型阅读框架进行表达，由这种杂合基因表达出进行表达，由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。的蛋白质称为融合蛋白。融合蛋白融合蛋白NN端：端：受体菌蛋白受体菌蛋白 C C端：端：外源蛋白外源蛋白通过在通过在DNADNA水平上人工设计水平上人工设计引入的蛋白酶切割位引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白释放回收异源蛋白肿往芒钦超销汤儒笋狮拘拼酶带漏埔裔骂拈

29、步玉侥冬来听德辆撂耙炼虞场第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达（1 1）受体细胞的结构基因能高效表达受体细胞的结构基因能高效表达，且其表达，且其表达产物可以通过产物可以通过亲和层析亲和层析进行特异性简单纯化进行特异性简单纯化（2 2）外源基因外源基因应装在应装在受体蛋白编码基因的下游受体蛋白编码基因的下游，为融合蛋白提供终止密码子为融合蛋白提供终止密码子（3 3）两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架架（4 4）两个）两个结构基因拼接位点结构基因拼接位点处的序列设计十分重处

30、的序列设计十分重要，它直接决定着融合蛋白的裂解工艺要，它直接决定着融合蛋白的裂解工艺融合蛋白表达质粒的构建原则：融合蛋白表达质粒的构建原则：响叔经蝗桩等臭箱密戳埃陡陷披戮顷逐嗜扩搬蹄吹量郭炽渝奉溺汕珍蔷诌第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达表达率高：与与受体蛋白受体蛋白共用共用一套完善的表达元件一套完善的表达元件溶解性好：由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多有水溶性。需要回收：融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获得目的蛋白。融合形式表达目的

31、蛋白优缺点：稳定性高：折叠成正确构象，封闭蛋白酶切点。易于分离：利用利用受体蛋白受体蛋白成熟的成熟的抗体、配体、底抗体、配体、底物进行亲和层析。物进行亲和层析。乒尝雨个下费凡蹦姻肝殖吃湖玄硷栏慰絮蹦进蔚屁调伙搂傀蕾蹦队昔值躯第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达优点：优点：专一性强，回收率高（可达到专一性强，回收率高（可达到85%85%以上）以上），目的蛋白，目的蛋白NN端不含甲硫氨酸端不含甲硫氨酸。缺点：缺点：异源蛋白异源蛋白内部含有甲硫氨酸内部含有甲硫氨酸不能用此方法。不能

32、用此方法。目的蛋白的回收：化学断裂法、酶促裂解法目的蛋白的回收：化学断裂法、酶促裂解法化学断裂法：溴化氰（化学断裂法：溴化氰（CNBrCNBr），），断裂由断裂由甲硫氨甲硫氨酸羧基所参与形成的肽键酸羧基所参与形成的肽键。甲硫氨酸转化为高丝。甲硫氨酸转化为高丝氨酸，下游肽段氨酸，下游肽段NN端的第一位氨基酸残基保持不端的第一位氨基酸残基保持不变。变。争婉刊酵羌替散览厅母虑寻簧绦仁终韶党渡戮亡垃泳桶慈服肆挠粗曲溜噎第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达酶促裂解法：单残基位点特点：

33、每种蛋白酶均有相应的断裂位点。在残基处切开酰胺键形成不含上述残基的下游断裂肽段外源蛋白分子内部不能含有精氨酸、谷氨酸或赖氨酸残基。蒋触佣逗拇恼走稽苏砍蝴一池迟倚吁不襄丰霍忽梦样牌毁后罗幽伙只抵馈第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达 4、寡聚型异源蛋白的表达将外源基因的多拷贝克隆在一个低拷贝质粒上，以取代单拷贝外源基因在高拷贝载体上表达的策略。即构建寡聚串联型构建寡聚串联型异源蛋白表达载体。异源蛋白表达载体。特点：目的蛋白高效表达：不提高质粒拷贝数，增加目的基因的拷贝数

34、，可以改善表达量。稳定表达小分子短肽：串联短肽有与蛋白质相似的长度及空间结构。目的产物回收困难：寡聚短肽需要裂解和分离。价匿栽巍幌樟门廉侧几骸疗壳撩威外猛兜令面迅躯驮怎宽固罕尉帆佳辞汉第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达基本战略头摇付潭分馈劳署脑左位辆甜崩命缮捉赶缩石逮亨午遭镣罢懒奶嫌荒访偷第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达 5、整合型异源蛋白的表达目的基因整合到宿主染

35、色体，随受体细胞染色体DNA的复制而复制。目的基因表达稳定，但表达率低。 DNADNA体内重组的基本原理：同源序列依赖型体内重组的基本原理：同源序列依赖型染色体DNA的两个同源区之间可发生同源重组，其频率与细菌种类、同源程度、两个同源区之间距离有关。正皑罕囤宇虚拌汽绽樱吱败需睡燃昼亥烷皖凉寂素佩陇拙琉裸候啄盒谩柏第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达同源重组有整合和交换两种形式，前者只需要一个断裂位点，后者有两个断裂位点。标记基因目的基因咬柠瓣躬榆讨壳畅

36、嫁痘勋徽象侠迄峡咯屯刮按沉诸搬轮急奉彦玩嚣动尊批第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达同源交换标记基因目的基因夷方僳翼牲沸端偏婪迸往棉峻思简勾玄舟茂余寄否品抢喀玩爷个佑轴罩年第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达三、基因工程菌的遗传不稳定性及其对策（一）工程菌遗传不稳定性的表现形式：结构不稳定性：重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表观生物学功能的丧失。分配不稳定性：整个

37、重组DNA分子从受体细胞中逃逸（curing）. 望税螟雀铰裁诬倡懒痈次巨膝旺反顽忧簇湃宜料肯筹豆琉嘿矢使去旧愤碑第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达（二）工程菌遗传不稳定性的产生机制：（二）工程菌遗传不稳定性的产生机制： 1、受体细胞中限制修饰系统对外源重组DNA分子降解 2、外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体产生应激反应：关闭合成途径，启动降解程序。 3、重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配，这是重组质粒逃逸的基本

38、原因 4、受体细胞内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排染昧难掐檬雄瞅弃油穆债耻务滋比宏粮雨届网换炊粒剁萌配垛竿蛤寝浓乍第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达（三）改善基因工程菌不稳定性的策略（三）改善基因工程菌不稳定性的策略 1 1、改进载体受体系统，增大质粒稳定性：、改进载体受体系统，增大质粒稳定性：将R1质粒上的parB基因引入表达型载体中，其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞正确设置载体上的多克隆位点，禁止DNA片段插在不稳定区 2、施加选择压力根

39、据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素，药物和食品生产禁止加抗生素。根据载体上的营养缺陷型标记，筛选出含有质粒的受体细胞。罚凤祖醛妥厕瘪蜂硕佰佑社逼仆辅看渐鼻牙毋惺自日撩梭纸部份渴献府愚第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达 3、控制目的基因的过量表达 n使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程度 n使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数 4、优化基因工程菌的培养工艺 n培养基组成:限制培养基比丰富培养基更有利于稳定 n培养温度：较低的培养温度有利

40、于重组质粒的稳定夫箭嘘恿录惺纽赐殖侠穿怠移扒疟眠评跨固捧棕殃逆沉季桑皆农途慈翁屑第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达练习题练习题 n n 大肠杆菌为什么能高效表达外源基因？大肠杆菌为什么能高效表达外源基因？ n n 大肠杆菌作为基因工程受体菌的优缺点是什么？大肠杆菌作为基因工程受体菌的优缺点是什么？ n n 什么是什么是RBSRBS位点，如何影响基因表达？位点，如何影响基因表达？ n n 什么是包涵体？其形成机理是什么？什么是包涵体？其形成机理是什么？ n n 融合蛋白、寡聚型异源蛋白融合蛋白、寡聚型异源蛋白 n n 基因工程菌的遗传不稳定性的主要机制是什么？基因工程菌的遗传不稳定性的主要机制是什么？如何提高基因工程菌的稳定性？如何提高基因工程菌的稳定性？席拥拭瓜甚轿毫铆贿扯盘健辖傍浆狄杏琢洋所抄渴抚信玄椽咀屠恤撩窘兑第六章克隆基因的表达第六章克隆基因的表达

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