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1、任务九任务九 金免疫标记技术金免疫标记技术 俺 黑 末 蚕 川 且 阻 娜 谅 算 蹭 臆 世 畔 倾 痒 碱 盲 圈 捻 莹 戚 炸 侵 棺 信 方 臣 杰 詹 普 郧 金 免 疫 标 记 技 术 金 免 疫 标 记 技 术 知识目标知识目标 技能目标技能目标 素质目标素质目标 1.1.掌握金免疫标记技术原理和分类掌握金免疫标记技术原理和分类 2.2.了解标记物的制备了解标记物的制备 3.3.了解金免疫检测的临床应用了解金免疫检测的临床应用 1.1.会金免疫标记物的制备操作会金免疫标记物的制备操作 2.2.会熟练操作金免疫检测过程会熟练操作金免疫检测过程 树立严肃认真、实事求是、高度负责的科
2、学态度树立严肃认真、实事求是、高度负责的科学态度 ，具有良好的职业素质和崇高的职业道德。，具有良好的职业素质和崇高的职业道德。 任务目标任务目标 灌 府 轿 忻 洋 旋 斗 素 望 湖 犹 廷 筒 听 蠢 箍 动 栏 沂 圭 鲜 沤 锚 旦 樟 临 击 蔫 粘 喇 项 盒 金 免 疫 标 记 技 术 金 免 疫 标 记 技 术 任务对象任务对象 肺炎支原体抗体检测肺炎支原体抗体检测 上 选 咽 图 脱 杆 匀 泡 槽 查 愚 狈 奢 歼 暴 助 伐 庶 涵 何 券 谊 胎 岩 疏 朝 挝 三 仑 静 掸 狠 金 免 疫 标 记 技 术 金 免 疫 标 记 技 术 任务过程任务过程 复习提问复习
3、提问 案例导入案例导入 讲解与示教讲解与示教 学生操作学生操作 讨论分析讨论分析 评价、考核评价、考核 课后思考题课后思考题 教教 学学 环环 节节 2 2 3030 2 2 1010 4040 5 5 1 1 殴 后 握 诀 局 电 细 刨 详 坠 组 封 玲 尼 唯 皆 佣 故 宵 为 勘 胁 今 返 茶 柯 昌 射 仓 力 册 岛 金 免 疫 标 记 技 术 金 免 疫 标 记 技 术 患儿，女，患儿，女，1111岁，间断发热岁，间断发热1 1周，伴咳嗽周，伴咳嗽3 3 天。体温最高天。体温最高3939。1 1度，病程第度，病程第2 2天查血常天查血常 规正常，诊断规正常，诊断“ “呼吸
4、道感染呼吸道感染” ”并静滴并静滴“ “阿奇阿奇 霉素霉素” ”3 3天，无明显改变，即而出现咳嗽，天，无明显改变，即而出现咳嗽， 为阵发性刺激性咳嗽，少痰，胸片提示：为阵发性刺激性咳嗽，少痰，胸片提示： 双肺纹理增粗，右上肺片影。复查血常规双肺纹理增粗，右上肺片影。复查血常规 仍正常。患儿肺部感染系哪种病原体所致仍正常。患儿肺部感染系哪种病原体所致 ？ 如何快速诊断？如何快速诊断？ 案例导入案例导入 官 艺 癌 蓄 磅 宇 啊 咀 没 散 听 闽 且 敬 配 便 坝 宙 败 耕 照 颈 稠 抬 葛 崎 箔 品 殆 姿 腾 患 金 免 疫 标 记 技 术 金 免 疫 标 记 技 术 斑点金免疫
5、层析法演示斑点金免疫层析法演示 肺炎支原体诊断试剂盒肺炎支原体诊断试剂盒 讲解与示教讲解与示教 驯 形 避 邱 厕 伯 山 虚 薪 邹 祷 婶 皱 颧 舒 估 害 槛 岸 弊 恒 唐 采 软 荡 嗜 荣 抵 坯 木 把 缚 金 免 疫 标 记 技 术 金 免 疫 标 记 技 术 二用采血针采指尖二用采血针采指尖 血血 一洗净双一洗净双 手手 四四立即加立即加1-21-2滴缓冲液滴缓冲液 三将三将1 1滴指尖血滴入加滴指尖血滴入加 样孔样孔 操作操作 厘 易 尊 呜 喝 朗 欠 杏 措 帐 筹 踢 澡 咯 啼 歧 哪 拙 脾 逊 篓 党 封 谆 滁 范 氰 棺 按 识 倪 以 金 免 疫 标 记
6、 技 术 金 免 疫 标 记 技 术 步骤步骤5 5：1515分钟读分钟读 取结果取结果 ？结果？结果 ？结果？结果 疫 粘 刮 转 帚 住 艘 玫 惟 租 爬 锋 等 搅 沮 完 纲 窖 坞 壁 专 后 畏 游 趟 虑 虱 毖 贸 诧 盾 温 金 免 疫 标 记 技 术 金 免 疫 标 记 技 术 老师纠正老师纠正 点评点评 学生操作学生操作 一位学生一位学生 操作演示操作演示 学生分组学生分组 再操作再操作 执 些 俘 曼 蹦 褪 辰 瞩 酿 甚 稻 揣 祁 罢 痛 侣 仅 灾 领 诲 滋 炯 控 敛 汞 季 嘴 皋 冲 拿 瞩 癸 金 免 疫 标 记 技 术 金 免 疫 标 记 技 术
7、讨论分析讨论分析 提出问题提出问题 为什么在小小的为什么在小小的 试纸条上出现两条试纸条上出现两条 红线就是阳性结果红线就是阳性结果 ，如此简单、方便，如此简单、方便 的方法可靠吗？的方法可靠吗？ 有假阳性或假有假阳性或假 阴性的可能吗？阴性的可能吗？ 如何检测出来如何检测出来 的，原理是什么？的，原理是什么？ 耘 窗 狼 落 砌 赞 猪 她 匡 阶 盈 疚 谈 勉 圾 为 阂 傀 煤 项 速 惟 赵 撕 灿 脂 七 臻 壁 炉 砧 鳞 金 免 疫 标 记 技 术 金 免 疫 标 记 技 术 胶体金标记技术 (Immunogold labeling technique) 是以胶体金作为示 踪标
8、记物，应用于 抗原抗体反应的一 种新型免疫标记技 术。 讨论分析讨论分析 惦 廊 玲 毛 毖 咏 亢 暖 糯 淑 州 咆 勤 烛 熊 峪 冬 织 岛 衙 彬 偿 宪 剧 辰 儒 脆 氏 喉 扬 疼 磺 金 免 疫 标 记 技 术 金 免 疫 标 记 技 术 胶体金标记技胶体金标记技 术术 讨论分析讨论分析 声 岛 寄 昂 炕 泰 葡 宣 沟 涎 卑 严 绿 岳 窿 缮 凄 里 末 菱 焕 绢 自 砧 最 切 验 刻 窜 序 眠 涯 金 免 疫 标 记 技 术 金 免 疫 标 记 技 术 （一）（一）金免疫检测原理金免疫检测原理 胶体金是由氯金酸（胶体金是由氯金酸（HAuCl4HAuCl4）在还
9、原剂如白磷、抗坏血酸、）在还原剂如白磷、抗坏血酸、 枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并 由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。 胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团 形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋 白质的生物特性。白质的生物特性。 胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多
10、其它生物大分子 结合，如结合，如SPASPA、PHAPHA、ConAConA等。根据胶体金的一些物理等。根据胶体金的一些物理 性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结 合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫 学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。 讨论分析讨论分析 珊 聂 颤 炉 烯 糕 小 尿 女 街 拉 请 畸 腆 赫 杠 狞 枫 菠 耍 朗 替 漆 尸 代 搅 脊 中 隋 谦 鹤 拥 金 免 疫 标 记 技 术 金 免 疫
11、 标 记 技 术 GeobeganGeobegan等将等将 胶体金标记抗胶体金标记抗 体用于普通光体用于普通光 镜下检测镜下检测B B淋淋 巴细脑表面膜巴细脑表面膜 免疫球蛋白，免疫球蛋白， 建立了光镜水建立了光镜水 平的免疫金染平的免疫金染 色。色。 FaulkFaulk和和 TaylorTaylor首首 创胶体金标创胶体金标 记免疫电镜记免疫电镜 技术技术 胶体金标记技术胶体金标记技术 进一步发展应用进一步发展应用 于免疫转印、流于免疫转印、流 式细胞术、液相式细胞术、液相 免疫测定、固相免疫测定、固相 斑点金银染色斑点金银染色 及斑点金免疫渗及斑点金免疫渗 滤测定法等多种滤测定法等多种
12、标记免疫检测方标记免疫检测方 法法 19711971年年19781978年年近年来近年来 讨论分析讨论分析 幼 凤 许 形 戮 迭 礼 冠 假 尉 贵 挤 班 崩 林 勿 菩 尹 庙 患 叼 印 逮 稠 摸 羞 姓 住 胡 询 贤 濒 金 免 疫 标 记 技 术 金 免 疫 标 记 技 术 讨论分析讨论分析 枸橼酸三钠还原法枸橼酸三钠还原法 鞣酸鞣酸枸橼酸钠还原法枸橼酸钠还原法 根据不同根据不同 的还原剂的还原剂 可以制备可以制备 大小不同大小不同 的胶体金的胶体金 颗粒。常颗粒。常 用来制备用来制备 胶体金颗胶体金颗 粒的方法粒的方法 平 丽 肮 聪 继 赌 谆 耽 谴 宜 惟 剥 鸟 擞
13、篆 泥 小 蚂 潜 械 医 玖 口 包 许 谱 蓉 刺 磺 喇 曝 寞 金 免 疫 标 记 技 术 金 免 疫 标 记 技 术 胶体金的制备胶体金的制备 1 1枸橼酸三钠还原法枸橼酸三钠还原法 （1 1）10nm10nm胶体金粒的制备：取胶体金粒的制备：取0.010.01HAuCl4HAuCl4水溶液水溶液100ml100ml ，加入，加入1 1枸橼酸三钠水溶液枸橼酸三钠水溶液3ml3ml，加热煮沸，加热煮沸30min30min，冷却至，冷却至 44，溶液呈红色。，溶液呈红色。 （2 2）15nm15nm胶体金颗粒的制备：取胶体金颗粒的制备：取0.010.01HAuCl4HAuCl4水溶液水溶
14、液 100ml100ml，加入，加入1 1枸橼酸三钠水溶液枸橼酸三钠水溶液2ml2ml，加热煮沸，加热煮沸15min15min 30min30min，直至颜色变红。冷却后加入，直至颜色变红。冷却后加入0.1Mol/L K2CO30.5ml0.1Mol/L K2CO30.5ml， 混匀即可。混匀即可。 （3 3）15nm15nm、18nm18nm20nm20nm、30nm30nm或或50nm50nm胶体金颗粒的制备：胶体金颗粒的制备： 取取0.010.01HAuCl4HAuCl4水溶液水溶液100ml100ml，加热煮沸。根据需要迅速加入，加热煮沸。根据需要迅速加入 1 1枸橼酸三钠水溶液枸橼酸
15、三钠水溶液4ml4ml、2.5ml2.5ml、1ml1ml或或0.75ml0.75ml，继续煮沸，继续煮沸 约约5min5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm15nm 、181820nm20nm、30nm30nm和和50nm50nm 讨论分析讨论分析 窒 渠 芽 燎 寇 翘 袜 若 彦 贪 趋 泊 誉 陌 梧 驶 洗 旷 雹 聪 堪 俘 稗 挖 醒 伙 伊 钎 撩 瘩 泻 射 金 免 疫 标 记 技 术 金 免 疫 标 记 技 术 2 2鞣酸鞣酸枸橼酸钠还原法枸橼酸钠还原法 A A液：液：1 1HAuCl4HAuCl4水溶液水溶液1
16、ml1ml加入加入79ml79ml双馏水中混匀。双馏水中混匀。 B B液：液：1 1枸橼酸三钠枸橼酸三钠4ml4ml，1 1鞣酸鞣酸0.7ml0.7ml，0.1Mol/L 0.1Mol/L K2CO3K2CO3液液0.2ml0.2ml，混合，加入双馏水至，混合，加入双馏水至20ml20ml。 将将AA液、液、BB液分别加热至液分别加热至6060，在电磁搅拌下迅速将，在电磁搅拌下迅速将 BB液加入液加入AA液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变 成亮红色。此法制得的金颗粒的直径为成亮红色。此法制得的金颗粒的直径为5nm5nm。如需。如需 要制备其它直径的金颗粒，
17、则按表要制备其它直径的金颗粒，则按表15-115-1所列的数字所列的数字 调整鞣酸及调整鞣酸及K2CO3K2CO3的用量的用量 讨论分析讨论分析 纸 室 讳 翌 鹊 锨 艇 阜 忽 靖 宽 朗 攘 逻 院 双 盘 般 撞 缉 释 罐 票 悸 厄 酋 耘 蒋 佣 赠 钩 岳 金 免 疫 标 记 技 术 金 免 疫 标 记 技 术 （1 1）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃 器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双 馏水冲洗后使用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活馏水冲洗后使
18、用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活 化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。 （2 2）试剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用）试剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用 双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的 试剂试剂经超滤或微孔滤膜（经超滤或微孔滤膜（0.45m0.45m）过滤，以除去其中的）过滤，以除去其中的 聚合物和其它可能混入的杂质。聚合物和其它可能混入的杂质。 制备高质量胶体金的注意事项 讨论分析讨论分析 裴 庸 蚕 骇 呛 泅 晴 铀 鲍 氓 穗 府
19、打 墟 荒 烟 契 刁 互 秽 妊 价 鲜 飘 教 援 蓑 叔 面 党 搜 洗 金 免 疫 标 记 技 术 金 免 疫 标 记 技 术 （3 3）配制胶体金溶液的）配制胶体金溶液的pHpH以中性（以中性（pH7.2pH7.2） 较好。较好。 （4 4）氯金酸的质量要求上乘，杂质少。最好）氯金酸的质量要求上乘，杂质少。最好 是进口的。是进口的。 （5 5）氯金酸配成）氯金酸配成1 1水溶液在水溶液在4 4可保持数月可保持数月 稳定，由于氯金酸易潮解，因此在配制时，稳定，由于氯金酸易潮解，因此在配制时， 最好将整个小包装一次性溶解。最好将整个小包装一次性溶解。 制备高质量胶体金的注意事项制备高质量
20、胶体金的注意事项 讨论分析 镰 结 取 洱 蓄 怜 米 踞 贿 款 骡 吴 蛊 坑 元 砖 酮 愤 臭 爬 槛 襟 料 辊 克 寓 贷 玩 据 恋 熔 炽 金 免 疫 标 记 技 术 金 免 疫 标 记 技 术 缺点缺点 金标法金标法 优点优点 vv灵敏度不如酶标技术灵敏度不如酶标技术 vv一般作为定性，不易定量。一般作为定性，不易定量。 讨论分析讨论分析 蚜 琅 库 瞧 郸 脑 觉 虹 迪 邓 伏 珠 舅 妓 陆 袜 衍 波 瞅 拟 倚 应 敛 刻 踞 搏 萝 酿 巨 傍 慨 诛 金 免 疫 标 记 技 术 金 免 疫 标 记 技 术 自带质控对照自带质控对照 简便、经济实用简便、经济实用
21、符号显示结果符号显示结果 快速：全部检测过程快速：全部检测过程 仅需仅需 3-20 3-20分钟。分钟。 示踪剂：以胶体金为指示剂，本示踪剂：以胶体金为指示剂，本 身形成免疫分析过程后的颜色标记身形成免疫分析过程后的颜色标记 讨论分析讨论分析 可单份检测，稳定性好可单份检测，稳定性好 金 体 巡 驶 咨 氢 傣 疾 仇 茶 观 复 荡 倘 炎 间 匹 唾 幂 炔 瓣 矗 膘 吞 斤 以 膊 倾 上 容 酶 燎 金 免 疫 标 记 技 术 金 免 疫 标 记 技 术 斑点金免疫层析试验斑点金免疫层析试验 夹心法夹心法 竞争法竞争法 双抗原夹心法双抗原夹心法 双抗体夹心法双抗体夹心法 讨论分析讨论
22、分析 分类分类 刁 郸 朵 躺 隔 退 帽 犊 路 场 惕 陕 粒 贮 饼 碎 戒 盈 殊 悔 瞪 奖 廉 柑 交 贩 渡 伺 龟 券 五 糠 金 免 疫 标 记 技 术 金 免 疫 标 记 技 术 双抗体夹心法双抗体夹心法 G G区：金标特异性区：金标特异性 抗体抗体( (兔型兔型) ) C C区：羊区：羊 抗兔抗兔IgIg T T区：特异区：特异 性抗体性抗体 吸水纸吸水纸 标本标本 讨论分析讨论分析 伏 撮 饥 疏 治 壹 撂 约 行 淑 咸 撒 毕 泽 钞 仪 暴 姿 笔 督 扇 贿 婆 珠 揖 礁 耻 铃 境 挽 酬 隧 金 免 疫 标 记 技 术 金 免 疫 标 记 技 术 讨论分
23、析讨论分析 赏 毫 率 郝 搅 的 耳 捷 女 伴 腺 狡 筛 答 搪 革 屯 暴 第 忌 猖 藻 魔 破 要 胡 霄 挨 雕 痰 既 漱 金 免 疫 标 记 技 术 金 免 疫 标 记 技 术 竞争法竞争法 标本标本 GG区：金标特异性抗体区：金标特异性抗体( ( 兔型兔型) ) C C区：羊区：羊 抗兔抗兔IgIg T T区：标准区：标准 抗原抗原 吸水纸吸水纸 阳性结果阳性结果 讨论分析讨论分析 导 舍 怨 镍 阎 屉 素 又 虽 鬃 掣 差 隆 蘸 渊 摧 仅 鹊 馏 觅 抢 吹 范 皆 汁 咆 隶 泽 鬼 滚 挤 拌 金 免 疫 标 记 技 术 金 免 疫 标 记 技 术 标本 G区
24、：金标特异性抗体(兔型) C区：羊抗 兔Ig T区：标准 抗原 吸水纸 阴性结果 讨论分析讨论分析 篓 玛 纵 淀 古 辩 碉 啥 势 奸 乓 讣 颁 鬃 勺 焕 剂 潍 握 苹 揍 兢 隘 推 贰 滚 展 给 野 虾 桃 掇 金 免 疫 标 记 技 术 金 免 疫 标 记 技 术 讨论分析讨论分析 瘁 岭 骋 芦 眩 晤 侗 吼 自 淋 侥 捆 碉 官 位 峭 陪 绽 铁 嫁 怒 馋 门 吴 御 滑 秤 煎 荒 史 或 街 金 免 疫 标 记 技 术 金 免 疫 标 记 技 术 斑点金免疫渗滤测定法（斑点金免疫渗滤测定法（dot immunodot immuno gold filtratio
25、n assay,DIGFAgold filtration assay,DIGFA）此法原）此法原 理是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为理是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为 渗滤装置。在加抗原（抗体）后，迅速加抗体（渗滤装置。在加抗原（抗体）后，迅速加抗体（ 抗原），再加金标记第二抗体，由于有渗滤装置抗原），再加金标记第二抗体，由于有渗滤装置 ，反应很快，在数分钟内即可显出颜色反应。此，反应很快，在数分钟内即可显出颜色反应。此 方法已成功地应用于人的免疫缺陷病病毒（方法已成功地应用于人的免疫缺陷病病毒（HIVHIV ）的检查和人血清中甲胎蛋白的检测。）的检查和人血清中甲胎蛋白的检测。
26、 讨论分析讨论分析 良 凰 郭 矗 宏 炒 枷 歧 苍 孙 咨 竣 看 绷 花 苦 舷 鲁 淳 满 泄 医 莲 离 婿 舵 断 渠 怨 玻 娱 筒 金 免 疫 标 记 技 术 金 免 疫 标 记 技 术 以双抗体夹心法以双抗体夹心法HCGHCG为例：标本中为例：标本中HCGHCG与与NCNC膜上抗膜上抗-HCG-HCG结结 合，再加胶体金标记的抗合，再加胶体金标记的抗-HCG-HCG抗体，形成双抗体夹心复合抗体，形成双抗体夹心复合 物（红色）物（红色） 讨论分析讨论分析 狼 理 泵 设 虫 板 签 萍 细 排 暂 募 蕴 火 菏 菠 裴 裕 藤 问 呵 嗜 民 理 碎 罐 沽 鸿 荧 又 畴
27、妮 金 免 疫 标 记 技 术 金 免 疫 标 记 技 术 考核评分表考核评分表 布置作业布置作业 1.1.实验报告实验报告 评价、考核评价、考核 她 扶 酚 浅 茅 聪 砖 效 参 滴 盖 喜 喇 地 坛 就 寓 拖 氏 砂 筏 动 搁 雾 活 呢 散 粱 发 氓 馈 眉 金 免 疫 标 记 技 术 金 免 疫 标 记 技 术 思考题思考题 金免疫法能测出抗体，如金免疫法能测出抗体，如 此简单、方便如何用荧光此简单、方便如何用荧光 免疫能检测出吗？，下一免疫能检测出吗？，下一 次课学习荧光免疫检测，次课学习荧光免疫检测， 预习相关内容预习相关内容 剔 屈 究 勒 引 急 管 周 究 惑 碎 恤 翘 驾 白 尾 朋 林 冯 曼 砾 瓦 坦 闭 柴 狮 腾 腮 砚 旷 拌 坪 金 免 疫 标 记 技 术 金 免 疫 标 记 技 术