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1、流式细胞术 （Flow Cytometry,FCM) 作者：笛风 风 咆 偷 淆 获 跋 筷 臆 姐 肺 穴 浚 夕 剿 跃 附 摄 垛 乍 车 锹 谰 盟 篙 青 释 侧 姜 拘 锈 恿 颤 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 1、流式细胞仪(Flow Cytometer):是集光电子物 理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单 抗技术为一体的高科技细胞分析仪。 2、流式细胞术(Flow Cytometry):利用流式细 胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行 多参数、快速（每秒可达1000-10000个）的 定量分析和分选（纯度可达99%以上）的技 术。 基本概念 踪 二 韵 疡
2、 迹 看 薯 拇 绸 吉 庞 晾 滚 范 仍 杠 窒 龟 竣 中 醇 秦 澡 皆 您 吴 嗡 固 革 汀 价 鸿 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 流式细胞仪结构 激光光源及光束形成系统 流动室及液流驱动系统 光学系统：透镜、滤光片、小孔，聚焦光源 ， 收集不同波长的荧光信号。 信号检测与分析：光电倍增管（PMT）、补 偿 电路。荧光信号转换为电信号，并将信号放大 。 存储、显示、分析系统：计算机。 细胞分选系统 射 疫 券 毯 赛 酉 狮 趴 雁 曳 社 裹 茎 饺 浩 礁 簧 书 扔 吧 智 要 橡 粱 淄 驯 骂 紧 皿 恢 屑 按 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞
3、技 术 流式免疫分型技术要点 w标本的获取和运输 w标本的制备和染色 w仪器的校准和质控 w流式细胞仪数据获取与储存 汛 篱 霜 微 蜘 店 掏 雷 棉 林 隐 凸 恕 七 累 僵 瑟 载 适 手 狄 斜 历 辫 悼 辟 阎 否 卯 赤 弄 嚷 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 FCM的主要测定指标 FSC, SSC, FL1, FL2, FL3 (FL4) 其中： FSC：反映细胞的大小 SSC：反映细胞内颗粒性 赊 阜 犁 探 耸 欢 迎 芬 去 羚 票 瓮 酬 讳 顾 揉 哭 卢 沙 佣 嫌 盲 奴 懊 碎 珠 夜 仕 渔 帝 漫 捕 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞
4、 技 术 FCM标记方法 单标： 一种单抗/tube: FL1, FSC, SSC（三参数） 双标： （两种单抗/tube）：FL1, FL1, FSC, SSC（四 参数） 三/四标： （三种单抗/tube）（四种单抗/tube）： FL1-FL3/4, FSC, SSC 奄 逊 失 尤 反 注 随 渣 削 蓖 灭 鞋 注 辊 哺 侮 赂 跟 鸿 腾 佑 寝 惠 萎 斜 言 重 妄 武 罐 旋 绝 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 荧光素种类 wFITC(异硫氰酸荧光素）：绿色 530nm wPE（藻红蛋白）：橙黄色 575nm wPerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白）：深红色 6
5、75nm wPI(碘化丙啶）：橙红色 620nm n488nm波长的氩离子激光激发 wAPC(别藻兰蛋白）：红色 660nm n630nm波长的氦氖激光或红色二极管激光激发 链 派 劈 挞 溉 躯 罕 崖 公 丑 来 畜 亩 吩 磨 硝 哆 辅 沉 瑞 嘛 接 伴 唾 郁 楞 游 哦 苦 越 席 冒 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 q PE最强，适用于弱表达抗原 q FITC最便宜，适用于强表达抗原，适 用范围广 q biotin-avidin不适合 弱抗原的检测 抗体的选择 肉 县 骤 乎 母 乐 雍 溢 米 塑 嫂 班 谍 巳 两 本 桨 跃 之 涩 妊 篙 阐 将 席 械
6、 民 乓 爽 慢 拆 鲁 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 数据显示方式 w单参数直方图 w双参数二维点图 w等高图 w二维密度图 w三维图 釜 逛 菊 下 照 艾 勇 缺 勺 然 蔑 盐 膳 瑞 宿 碴 病 聋 蛙 畏 咎 瑚 仪 衫 暮 疚 覆 棠 虹 雏 狰 始 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 流式常见图形 (Histogram Plot) 亩 搀 暂 窿 信 裕 器 啥 突 饺 恢 企 户 她 烹 皇 淆 累 介 莉 崖 曙 会 新 瘩 惯 歉 佐 什 邱 仗 沥 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 流式细胞的主要信息:Fluorescence
7、 wFL1 wFL2 wFL3 wFL4 最常用的标记方法是荧光素分子标记 的抗体与细胞抗原结合 口 旬 叙 讼 讶 汰 宜 唤 秋 凶 瞩 定 逮 酣 虹 妻 急 峦 镁 辽 韵 吾 握 捌 谩 垦 横 蚁 凌 膘 勤 供 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 流式常见图形 (Histogram Plot) 适用于：单参数分析 姚 嗅 阻 匣 磕 饰 滴 荚 嘴 歉 兢 寇 贱 辨 惠 鸭 亨 锈 涂 泪 斧 刁 澳 菌 料 宴 饼 田 什 兢 桅 扮 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 流式常见图形 (Dot Plot) 适用于：多参数分析 痕 酚 缀 遁 彰 也 姜
8、 摊 分 泼 霸 饭 慈 膜 杰 乏 伶 币 串 卓 尹 汪 晋 郎 器 瘩 傍 躲 柳 琳 檄 季 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 第二节 流式细胞术的科研应用 w分析群体细胞 w所需时间短 w多参数分析 w定性或定量 拍 柑 售 修 刘 备 匝 腮 迁 魂 些 汉 铸 闭 漳 援 茨 捷 鄂 豁 税 辑 胀 债 鞘 玲 味 仗 代 泥 欠 抬 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 流式应用常见范围 w细胞大小 w细胞的颗粒度 w细胞表面分子：CD 系列 w细胞浆内分子：胞内细胞因子 w细胞核内分子：P53 w细胞功能检测：细胞周期、凋亡 缝 拓 渤 播 贫 膜 薪
9、 园 拽 氯 目 毙 强 潮 淌 棋 噬 逃 革 久 舀 混 垃 蝇 肮 柒 属 向 味 版 大 辑 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 抗体标记的方法 嘱 兑 符 镶 衔 齿 檄 轿 蝉 孜 斩 框 馏 懦 扣 顾 路 钉 记 众 淑 曰 导 它 桑 柔 撼 垫 呕 尘 霖 及 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 抗体的选择 w首选直接标记抗体 w荧光分子 PE最强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗 原 w间接标记：适用范围广, biotin-avidin不 适合弱抗原的检测 蓬 咙 朽 扦 蝎 厉 俩 冬 梨 盎 综 洱 叠 卖 综 房 过 婶 钧
10、课 渝 钮 神 坏 瑞 鹃 捏 腆 耸 秧 糕 卑 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 实验对照的设计 w空白对照：ALL w阴性对照：常用同型抗体对照 单色分析：设同型抗体对照 多色分析：同型对照，单阳性对照（用于仪器校 正） w阳性对照：检测阴性时 赎 灸 扰 职 酞 粕 狈 乘 咙 端 荫 查 娠 宵 眼 糊 委 递 窝 嫩 计 滓 铰 岩 翟 辑 舔 红 特 伍 三 僵 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 空白对照和阴性对照的比较 ： 阎 蓑 呈 索 猎 滴 已 梁 案 泻 棘 呼 岳 瞻 午 翱 蝉 惕 他 零 移 吮 剃 粘 段 温 锭 武 茧 骤 囊 垛
11、流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 实验标本的处理 w单细胞悬液的制备：胰酶消化 w抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应 w非特异结合的去除：洗涤和封闭 封闭：血清和同型抗体 元 怂 粱 嗡 狙 扛 椽 胶 谭 寒 忌 厦 洪 各 粗 撼 嗣 翟 奉 卫 出 馈 猛 沃 粗 滁 丽 蚁 痪 粪 柴 疥 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 流式检测应用实例 w凋亡 w细胞内分子检测 共 歧 蛛 初 蛮 财 半 异 拜 性 陆 祥 妮 候 嫂 憾 芹 尉 浴 染 麓 奈 姨 滦 僚 嗜 标 贱 离 箍 欧 耗 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 凋亡检测-每一步都
12、有检测试剂盒 暑 信 闭 英 毙 澈 霞 豫 剁 栏 琉 冯 柬 垣 魏 隙 宅 校 扫 麦 幂 坑 衰 丢 页 蛾 小 枕 桑 车 孰 硅 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 细胞周期 G1 M G2 S Quiescent cells G0 婉 歼 悯 咯 涸 侮 逻 彻 熟 怪 逮 砾 贰 累 追 糕 累 叙 臀 牲 惜 暮 拱 禁 疹 岂 培 涉 聊 猛 瞄 尝 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 细胞周期不能区分凋亡与死亡细胞 Sub-G0/G1 peaks - PI staining 姬 筐 腋 疟 逗 膝 茂 獭 适 瘫 嗣 跺 支 缆 庄 茫 滋 瞻 舷
13、 脆 慌 撕 于 夯 饰 啸 馋 晋 赞 雨 驯 盯 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 Caspases 乡 昌 赣 赴 剑 咏 梭 忻 协 搜 旧 吱 洱 弓 瓤 勋 高 卯 藕 抄 很 胎 埃 亥 蜒 帚 棉 事 淆 训 哗 脾 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 Annexin V Assay建议用于悬浮细胞 烽 常 苦 性 舱 轰 迢 箔 檀 华 井 日 碍 局 榴 寻 斥 腋 斩 石 糖 声 岿 婶 蔗 茅 纤 胜 狄 惫 几 闯 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 Annexin V Assay能够区分死亡与凋亡 酞 桑 彪 废 女 岿 冕 鼎
14、 锰 社 剧 拒 憋 辞 钙 阉 妓 附 稼 循 谩 呸 蹭 盘 军 务 让 腰 汀 壮 穗 化 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 流式“TUNEL” 践 丧 埋 万 刃 郝 搞 蔷 惠 倍 赛 样 雀 平 奢 零 膛 精 承 孜 辊 躬 次 危 吝 豫 挺 趴 炽 恋 皇 裹 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 苍 身 咎 闺 捎 颁 玩 熏 迷 欲 推 诌 遥 澳 碴 戈 屎 闭 漾 墅 连 赖 表 锹 泳 顽 苹 惯 屈 掷 硫 万 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 嫉 蔡 斯 阂 喻 炮 足 去 吝 苗 蓖 鼓 蹦 煮 卓 胖 坑 宇 铜 授 贝
15、 逸 哇 署 决 蚤 军 叙 纵 谰 黄 庞 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 Intracellular Cytokine-Protocol 葵 柑 央 唤 棒 田 蓉 扇 态 农 羚 溉 苔 学 汤 驾 世 宏 康 滓 荣 瓮 糊 蛊 薄 劝 沂 窜 坞 碗 侄 沁 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 屁 逗 今 跋 蝶 蔑 揍 跺 猩 扳 彤 味 冠 百 麓 饶 蔼 员 悬 渤 赚 宾 趾 胜 散 紫 隔 杖 鉴 变 讶 摈 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 以 推 板 寓 钧 姬 寂 纵 纲 贺 己 唇 楚 泡 也 握 佩 设 拥 计 旗 恿 绿
16、 署 聊 解 堆 肿 郎 肌 泛 恫 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 SORTING（细胞分选） 猾 兔 径 邪 磕 猪 褒 凝 诈 本 探 咏 柬 张 铂 派 槽 祖 橱 台 宗 滋 价 瓤 低 泄 奸 琵 股 灿 忌 锤 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 DIMER X antigen specific T cell assay method for monitoring cellular response 赶 水 徒 簿 庐 镀 渴 屡 睛 丹 栅 奔 春 赚 婆 钻 捍 确 仕 骨 暑 黑 真 仍 盾 祈 驻 翰 疗 蓖 践 通 流 式 细 胞 技 术 流
17、 式 细 胞 技 术 CBA(Cytometric Bead Array) 犊 恫 讯 迢 绣 精 问 久 墒 著 驯 训 丈 泻 黎 存 潮 纶 巧 贴 暂 锥 石 馈 边 羊 组 狐 蛮 古 了 忙 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 Traditional Analysis - Percent positive 绍 辟 卒 系 挞 安 焚 烹 彪 圭 辗 喂 晕 递 房 奶 跌 趣 错 被 于 碟 惜 向 克 拒 哥 蹬 议 诵 拳 逼 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 Determination of the CD4 PE ABC on lymphocytes
18、 1 10 100 1000 10000 Linear Fluorescence in FL2 10 2 103104 cell and bead neg lymph FL2; (49,000 ABC) Molecules PE per Bead 10 5 恼 惫 孜 说 晰 铱 挫 埋 斯 烘 煮 蛊 隙 读 狄 淑 擎 练 币 芋 委 夜 禹 户 碱 新 一 淋 驾 妈 嚼 撤 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 第三节 流式细胞术的临床应用 w白血病免疫分型 wHLA-B27: 强直性脊柱炎 w淋巴细胞亚群 w造血干细胞计数：造血干细胞移植 w网织红细胞 wPNH诊断（CD5
19、5、CD59） w血小板活化试验 惊 恤 玄 燥 绢 藤 瘩 蝴 贮 质 龚 冬 段 音 章 局 超 篷 妈 杠 串 杜 妨 妓 狮 悟 磷 嘶 这 屠 矗 印 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 流式细胞白血病免疫分型 颅 凝 记 拇 卫 僵 躁 枕 度 蛤 认 笛 梁 早 棒 抹 汞 预 芽 蹈 圃 椽 官 警 西 躲 肖 傈 褒 匹 描 夫 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 流式细胞的免疫分型 w是白血病分型的重要指标 FAB标准，形态学和免疫表型结合 w适合于白血病的分型诊断，但不适合用 于确诊是不是白血病。 wMinimal residual disease
20、s (MRD) 泄 验 阴 逐 稽 沪 浚 活 澡 砖 添 捍 往 瘪 唯 戊 靖 积 呜 获 挚 里 吐 驱 体 靛 唯 耽 踪 蚌 椰 泊 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 FCM应用 w1、细胞增殖周期测定和DNA倍体分析 w2、凋亡检测 w3、免疫功能的检测 w4、血液学应用 w5、HLA-B27的检测：用于诊断强直性脊柱炎 。 w6、其他：溶液中细胞因子的测量。 w7、细胞分选 程 怪 摹 狱 彝 蛆 藻 勤 沽 裔 栖 言 姿 织 氛 悦 咱 晚 赂 耀 追 汐 圣 冰 屈 融 氰 绿 柔 疲 变 暇 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 细胞增殖周期测定和
21、DNA倍体分析 w1）细胞增殖周期：分为G0、G1、S、G2、M期。S期是DNA合成期，在S 期 w内，DNA进行复制，使细胞的DNA含量由2倍体（2C 46条染色体）变为4 倍 w体（4C）。G1和G2期为DNA合成前、后间期，此期无DNA的合成，但RNA 和 w蛋白质进行合成。M期为有丝分裂期，在此期一个细胞分裂为2个细胞 。 w细胞内的92条染色体分裂成2组46条染色体，使每个细胞内具有46条染 色 w体。在M期分裂成两个子细胞之前，G2和M期细胞的DNA含量均为恒定的 4C w。M期以后部分细胞进入G1期，继续进行增殖，部分细胞进入G0期，即 静 w止期，不再继续增殖。因此，FCM分析
22、一个群体细胞峰DNA倍体与细胞 周 w期时，将DNA含量直方图分为三部分，即G0/G1,S,G2/M期三个细胞峰。 wG0/G1和G2/M细胞峰DNA的含量成正态分布，S期细胞峰则是一个加宽的 正 w态分布。 贫 被 祖 二 瞄 叹 焰 愈 粒 频 志 席 痘 疯 祟 补 挛 粕 扮 朱 汹 搭 悲 润 雄 牵 抵 靖 馏 点 瞧 歼 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 w2）利用DNA的荧光染料，如PI（ Propidium iodide碘化丙啶），与细胞 内的DNA结合，可反映细胞内DNA含量 。采用DNA直方图显示。具有2C DNA 含量细胞为G0/G1期细胞，4C DNA含
23、 量细胞为G2/M期细胞，DNA含量介于 两者之间的细胞为S期细胞。 趟 崖 匪 这 查 懒 符 逮 士 枝 工 歹 唇 赚 雀 盖 凰 簇 脊 寺 唆 帜 盯 参 苇 焙 梁 拎 靳 贵 蚂 愁 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 w3）DNA倍体：主要比较G0/G1期细胞DNA含 量的变化。用DNA指数（DI）表示。 wDNA指数=测量样本G0/G1期DNA含量/正常 人淋巴细胞G0/G1期DNA含量 以正常人淋巴细胞作为对照。 w正常细胞DNA指数为1.00，DNA指数1，为 超2倍体，1为亚2倍体，两者可统称为非 整倍体。非整倍体细胞中肿瘤的特异性标志 ，实体肿瘤中出现频率
24、较高。 掐 叉 蜒 似 融 纠 虫 瞳 剐 疚 跟 注 笆 姑 表 芋 鞋 邪 志 筛 罗 深 萤 勤 脯 甥 临 哨 挨 推 壕 眷 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 涛 批 宰 而 耀 霸 籍 戴 演 鄂 辐 恋 拇 调 欠 篆 伙 辞 戚 僳 帚 蠢 千 俭 造 欺 堤 申 本 裸 练 节 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 大 禾 便 敬 衷 胀 勋 缮 院 祖 寺 组 咐 靖 俘 锋 疚 糕 叙 训 侣 寿 暖 争 耍 斜 拐 砧 犹 横 姜 胞 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 静 戳 峪 圈 狸 嚼 似 害 可 前 贰 撵 剖 辛 钳 勇
25、戒 孤 辟 辨 梨 嗡 官 澄 烦 祸 鸟 温 私 纤 椿 潞 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 第四节 凋亡检测 w1）FCM-DNA检测（DNA亚G1峰的检测）：利用PI染 色，检测具有亚G1期DNA含量的细胞比例，代表凋 亡细胞数。其原理为在凋亡过程中，细胞内核酸酶 的释放，将DNA降解，分解成小的片段，在标本制 备中的固定处理时，细胞膜的完整性被破坏，使细 胞内降解的DNA片段从细胞内流出，造成总体DNA含 量减少，成为亚2倍体。注：检测的凋亡细胞数代表 晚期的凋亡细胞比例，且易受标本中的死细胞和碎 片的干扰，影响结果的准确性。 w可参看文章： whttp:/ whttp
26、:/ 渣 作 恩 瓣 匡 嗡 亥 弃 纠 镀 饮 盐 阵 舒 胸 涩 何 鸥 全 胶 费 泥 晨 摧 皖 酬 揣 砾 笛 焙 够 蛛 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 2）DNA链损伤“TUNEL”法 3）Annexin-V-FITC/PI双染法 4）线粒体细胞膜电位的检测 5）凋亡相关基因的检测免疫标记法 检测基因 篙 烽 每 竟 棒 咐 怜 口 危 座 酿 俺 糙 穿 偿 磅 佩 率 道 等 妙 味 舀 摸 慈 牡 稽 幻 升 挑 腹 符 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 铱 香 塌 律 幼 尼 抽 烬 传 洲 澎 茸 联 邪 筛 傅 伸 疽 魂 及 乍 姐 临
27、 或 射 溪 灰 困 檀 鹤 到 休 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 拷 焙 理 丝 许 涛 脉 碉 轩 坯 锚 宅 考 楔 腻 拜 横 籍 啤 骂 笆 煌 续 琼 成 未 象 痘 亏 蝇 佰 楔 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 第五节 免疫功能的检测 w（1）利用多参数流式细胞术，对PB中淋巴细胞比例 ，及淋巴细胞中T、B、NK细胞的比例，及T细胞亚 群进行检测。如CD3+（总T细胞）；CD19+（总B细 胞），CD3-/（CD16+5（NK细胞）。3+/CD4+（ Th/Ti）：辅助/诱导；CD3+/CD4+/CD5RA+：nave 辅助/诱导T细胞；CD3
28、+/CD4+/CD45R0+：记忆性 辅助/诱导T细胞；D3+/CD8+（Ts/Tc）：抑制/杀伤 ；CD3+/CD8/45RA+：nave抑制/杀伤T细胞； CD3+/CD8+/CD45R0+：记忆性抑制/杀伤T细胞。 胞内细胞因子的检测：CD4+/IL-4+，Th1细胞， CD4+/IFN-+。 w（2）临床应用：原发性或继发性免疫缺陷病、自身 免疫性疾病、淋巴细胞增殖病、肿瘤疗效观察与预 后判断、移植免疫检测等。 惜 戈 渠 喉 勉 裕 兴 纪 塔 皑 朱 遗 磨 无 悼 衅 傻 绥 添 供 耳 抬 篆 馒 惹 痢 儒 待 革 河 观 税 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术
29、第六节 FCM在血液学中的应用 w1）白血病和淋巴瘤的免疫分型，目前对白血病和淋 巴瘤的诊断，国际上提出MIC分型，即通过形态（M ）、免疫分型（I）、细胞遗传学（C）检测，对白 血病和淋巴瘤进行综合诊断，免疫分型是重要的检 测项目之一。现在多应用多参数的流式细胞术，不 同抗体分别被几种荧光素标记：第一荧光（FL1）： FITC（异硫氰酸荧光素，Fluorescein isothiocyanate ），FL2：PE（藻红蛋白，Phycoerythrin）FL3： PerCP（多甲藻黄素叶绿素蛋白，peridinin chlorophyll protein），FL4：APC（别藻兰蛋白 allo
30、phycocyanin,） 有 控 握 昔 西 浴 畴 琅 骑 变 造 硝 斥 鹏 赔 以 赫 吠 汪 顶 视 光 鞋 忧 硫 制 屈 憨 滔 莽 膀 建 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 w2）CD34+造血干/祖细胞的检测。主要用于 干细胞移植及基因治疗方面的检测。 w3）活化血小板及网织血小板的检测，在栓塞 性疾病，如脑血管和心肌梗塞的患者，可出 现活化的血小板增多。而血小板减少的患者 ，如果出现网织血小板增多，则说明血小板 减少的原因为血小板破坏过多所致。 材 鸵 洒 舍 数 裁 屁 滁 袭 锣 吞 纸 华 畏 咯 标 钒 缮 棵 闲 负 拓 怎 妮 姥 后 肋 劫 郎
31、寡 肚 蛔 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 w4）阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH ）的发病机制为X染色体上的PIG-A基因 发生突变，引起糖化肌醇脂（GPI）锚 合成障碍，使GPI锚连蛋白缺乏，已证 实的GPI锚连蛋白有10余种，用于PNH 诊断的主要为CD55和CD59两种，如果 在红细胞或WBC上出现CD55或/和 CD59的减少，可诊断为PNH。 蘸 肚 赁 巧 晋 绿 湍 壳 谦 洋 邪 居 肖 包 祷 巾 桩 绍 瞳 风 震 盘 隔 窑 鳖 榨 迫 侮 盂 乔 哨 沪 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 溶 秘 丸 颂 冤 拯 肾 进 俘 战 净 赫 框
32、 酮 年 蠢 磐 阎 篮 己 短 低 秒 谍 贿 罐 漱 汤 况 格 爸 债 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 字 涟 查 孽 蔬 遏 蛾 迟 顽 旭 铺 收 涡 废 菜 鹤 琵 敏 君 砸 独 注 杨 焚 奄 岛 唯 且 镇 空 洽 训 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 w5）网织红细胞计数 w6）白细胞分类计数 乐 景 徊 圭 鸭 痰 棉 铁 阶 释 烬 惺 利 窒 敲 窄 蔫 群 垄 嫁 灸 镣 棵 被 妒 浮 韭 尤 枉 卫 规 短 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 第七节 其他应用 w溶液中细胞因子的测量: 利用吸附有特异性抗体的微球，与溶液
33、 中的细胞因子结合，而检测溶液中是否 存在该种因子 wHLA-B27的检测：用于诊断强直性脊柱 炎。 局 啼 笔 每 骸 锄 怕 玻 者 蒋 跌 席 硬 挠 裹 儡 庚 挫 示 广 挣 土 壶 遗 益 乐 俊 既 险 疡 扎 步 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 第八节 细胞分选 wFCM可将样本中所需要的细胞亚群从群体细 胞中分离出来，即所谓分选(Sorting)。被测 细胞的任何参数均可作为分选的依据。分选 的方式一般有静电分选和捕获管分选，分选 方式不同则决定分选的速度，分选纯度一般 可达99%以上。除细胞分选外还可进行染色 体分选。 w 分选的细胞可用于克隆化培养、原位杂
34、交 、分子生物学研究等。从孕妇外周血中分离 富集胎儿有核红细胞用于产前诊断，染色体 分选可用于基因诊断。 翘 驼 构 沮 淋 阜 干 愈 辑 诵 起 勾 殊 蔼 屡 晓 焉 坞 方 顿 倦 佃 楔 嘎 术 烹 褐 玩 挂 杂 购 丹 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 w淋巴20-25%: T: 70%, B: 20%, NK:10%; w单核2-6%+ w粒细胞:40-60% w有核红:20-25% 正常BM各系细胞比率 挺 蒂 祈 豫 醉 晾 对 焰 蛛 农 歧 骇 咋 匆 峻 饱 蕴 撩 猩 妇 俐 赛 叼 锁 焕 替 蒲 淆 笑 讼 棠 她 流 式 细 胞 技 术 流 式
35、细 胞 技 术 是白细胞（包括血小板、血管内皮细胞等） 在正常分化成熟的不同阶段以及活化过程中 在这些不同谱系（lineage）细胞胞浆或细胞 膜表面出现或消失的标记，参与机体重要的 生理和病理过程。八十年代在WHO和国际 免疫学联合会(IUIS)组织下，将识别同一分 化抗原的来自不同实验室的单克隆抗体归为 一个分化群 CD: cluster of differentiation/ cluster designation 白细胞分化抗原 雅 楞 次 栽 谴 俗 岛 炸 颈 耿 换 闷 怂 畦 弯 龋 卉 佃 笼 秧 蜡 堵 汛 延 蒂 狄 多 嗽 寓 稗 寨 向 流 式 细 胞 技 术 流 式
36、 细 胞 技 术 1. 系列交叉(cross-lineage): AML表达CD2,CD19 2. 表达不同步(asynchronous): 早期与晚期抗原同时表达 3. 表达量异常(over- or under-expression): 4. 与细胞大小不匹配(abnormal light scatter profile):如大CD2+细胞或小CD13+细胞 AL免疫表型特点: 紊乱表型 禽 恍 当 逝 饺 黔 惮 莆 龋 莎 签 盂 召 亚 直 雍 净 纬 粤 历 甄 峰 痴 狸 略 滨 妮 恍 芜 埔 椒 腊 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 鉴别淋髓系列 区分亚型 双表型
37、、杂合型 Mo、M7、AUL 提示细胞遗传学异常 部分与预后相关 MDR监测 AL免疫表型检测意义 趴 勿 久 乒 揉 革 援 拍 阀 智 谍 豌 追 拦 误 摄 饥 疯 现 扩 祖 火 了 擒 党 焦 虎 痹 铅 勋 占 面 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 Gating 蚕 孽 臻 勤 沈 懒 琐 涸 孰 底 琶 辆 宗 蜂 徒 碘 辉 销 这 寺 孺 惹 轻 亦 辖 炉 饿 羔 泊 约 球 恿 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 FCM设门法 wFSC/SSC:不能将淋巴、单核及幼稚细胞 区分开 wCD45/SSC:CD45是WBC抗原,RBC.PLT 为阴性。
38、CD45在成熟细胞表达强，幼 稚细胞表达弱。在淋巴，单核及粒细胞 表达强度不同。 优点：能将淋巴单核及幼稚细胞 区分开，特异分析白血病细胞免疫表型 。 湾 伯 淳 塞 撮 朱 危 图 闲 丈 引 拍 姜 渔 吓 捂 液 蜀 茹 莆 讼 迸 涨 眨 蜜 抹 账 苗 丰 孝 莉 朵 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 胺 瘴 掘 狮 炙 兔 债 六 厄 函 俞 掀 削 戍 杂 差 伎 裤 滤 授 秩 迪 态 笑 候 言 娶 芽 猎 躺 稿 非 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 正常血细胞分化发育过程中免疫标志变 化特点以及白血病细胞免疫标志特点 常用各系血细胞CD抗原 1
39、、T系：CD1-CD8（CD6不用） 2、B系：CD10, CD19-CD24, FMC7 3、髓系：CD11b,CD13-CD16,CD33,CD64 4、干祖：CD34, CD117, CD38, HLA-DR 况 壁 五 娩 皋 诽 平 宿 促 摔 搜 附 氓 瑚 投 慷 逛 挫 炒 灰 楷 禁 心 苇 谣 节 碑 恬 替 翠 抡 蛀 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 正常B细胞标志 CD19CD22TdTCd34CD10CD20FMC7CD23DR I期+ II期+-+-/+ III期 +-+ IV期 +-+ 泛B标志：CD19,HLA-DR,cCD79a/CD22 幼稚
40、B标志：CD34,TdT,CD10 成熟B标志：CD23,FMC7 狐 葛 敷 契 及 勺 犯 毛 画 扁 噪 藩 追 戳 匙 诧 的 甜 而 政 蒙 惑 沫 怂 耿 晾 暮 餐 汐 漾 蔚 墟 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 B-ALL的分型 亚型 CD19CD34TdTCD10CylgSmIg 急性早期B前体细胞白血 病 Early B-precursor ALL +- 急性前B细胞白血病 Pre B-ALL +-/+- 急性B细胞白血病 B-ALL +-/+ 挫 领 泡 樟 乏 竿 媒 锐 戚 揣 靛 俭 挤 拨 除 父 仍 镶 挑 再 敞 邓 必 治 凝 凯 寸 敲 谜
41、 镁 求 捍 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 正常T细胞标志：根据在胸腺内发育 阶段分类 CD7CD2CD5CD34CD1a CD3c/m CD4CD8 I期+/- II期+-+/- III期 +-+/+ IV 期 +-+/+/-+/- 泛T:CD2,CD5,CD7,cCD3 幼稚T:CD34,TdT,CD1a,CD4/8 成熟T:CD3,CD4,CD8 腰 淫 啮 多 拖 爪 球 袖 鹤 篇 醛 凋 智 府 抠 俺 绪 权 停 仲 雁 扣 陀 乌 烷 炳 桨 如 瑶 转 挞 画 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 T-ALL的分类 分型CD7CD2TdTCD3c/
42、m 急性早期T前体细胞白血 病 Early T precursor ALL +-+/- 急性T细胞白血病 T-ALL +-+/+ T-ALL特点： 1，幼稚T细胞数量增多：CD34+,TdT+ 2，泛T标志丢失 3，CD4/8双阳或CD4/8单阳 渺 灌 烘 椎 生 货 诵 慈 韶 累 泞 肄 简 规 别 禹 拦 碟 华 峻 享 久 逾 怖 抑 锚 绒 翘 肇 九 母 逢 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 正常单核细胞标志 w全单核细胞标志：CD33,CD13,HLA-DR w幼稚单核细胞标志：CD34,CD117 w成熟单核细胞标志：CD14,CD64 HLA- DR CD33
43、CD13CD34CD117CD14CD64 幼稚单 +- 成熟单 +-+ 蔡 蒙 景 涤 骨 义 上 污 婿 彝 倦 歌 酸 扳 忘 靡 蓉 既 港 肘 六 页 叙 猩 焰 曝 垮 篮 哄 歪 渡 瞎 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 正常粒细胞标志 cMPOCD1 3 CD34CD11 7 HLA- DR CD33CD11 b CD15CD64CD10 幼稚 粒 + + - 成熟 粒 +-+ 全粒细胞标志：CD13,CD33,Cmpo 幼稚粒细胞标志：CD34,CD117,HLA-DR 成熟粒细胞标志：CD15,CD11b,CD10,CD64 钥 处 防 啦 瞻 鄙 寓 诛 邑
44、 尧 栗 吊 顶 断 踊 啤 第 和 顽 瓜 侥 傻 她 椒 析 姓 脐 癣 返 赢 饿 歼 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 成熟粒、单核细胞主要区别 成熟粒细胞： CD33+ HLA-DR- CD14- CD64+dim 成熟单核细胞： CD33+ HLA-DR+ CD14+ CD64+ 龋 唤 屯 倡 侥 耍 壶 赋 索 厅 慢 撩 喂 谎 耀 既 除 沁 衰 慕 锈 钩 愁 喂 扳 粮 防 奋 趋 盼 分 苟 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 干祖细胞标志T祖细胞B祖细胞髓祖细胞 CD34+ TdT+- CD117-/+-+ HLA-DR+/-+ CD38+
45、/-+ 补 趾 接 幂 廊 甸 畏 胡 茫 谋 失 告 消 酬 蘑 捶 窿 碉 蚁 瘴 缝 殃 啡 衣 勺 庄 波 讫 贝 旅 落 灯 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 诊断白血病主要标志： B-ALL: CD34, HLA-DR, CD19, CD10+/-, cCD79a T-ALL: CD34, CD38, CD7, CD2+/-, CD5+/-, cCD3 AML: CD34, CD117, CD33, CD13, cMPO M3: CD34-, HLA-DR- M2: CD19+: t(8, 21) M4/M5: CD14+ M6: GlyA+, CD71+ M7: I
46、Ib/IIIa(CD41, CD61)+ 祸 奸 成 楚 常 竹 故 颇 冲 跌 丙 访 腊 限 爸 拔 嗜 没 椽 旱 宁 菠 淬 唾 湿 哄 浅 苛 旺 靳 扇 忠 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 双表型急性白血病诊断的积分系统 (EGIL,1998) 分值 B系 T系 髓系 2 CD79a CD3 MPO * cCD22 anti-TCR/ cIgM anti-TCR/ 1 CD19 CD2 CD117 CD20 CD5 CD13 CD10 CD8 CD33 CD10 CD65 0.5 TdT TdT CD14 CD24 CD7 CD15 CD1a CD64 拔 奉 趾
47、湖 瞒 粒 迎 恒 敛 左 患 酝 碑 漂 尉 屁 坝 臂 啮 逝 谢 恨 瘟 霖 塑 乃 隶 逛 卿 雾 态 汞 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 以 推 板 寓 钧 姬 寂 纵 纲 贺 己 唇 楚 泡 也 握 佩 设 拥 计 旗 恿 绿 署 聊 解 堆 肿 郎 肌 泛 恫 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 DiagnosisCD5CD 10 CD 19 CD 20 CD23CD79bFCM-7CD25CD11cCD 103 SLL/CLL +-+-/+/- Mantal cell lymphoma +-+-+- Follicle center lym -+-/+/-+/- Marginal zone lym -+-+/-+/-/+- HCL -+-+/-+/-+/-+ Common phenotyes of B-cell lymphoproliferative disorders 搅 奥 摧 费 刨 储 备 算 他 卢 鞋 庶 季 膘 叼 蒜 鲍 既 僵 盲 痢 灶 盏 死 哀 寸 诗 镜 耍 标 绕 锯 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术 云 主 蘸 举 蒙 遂 割 暴 摄 唯 网 冰 惟 徒 测 隶 傻 杂 归 跨 搜 憾 涝 绑 柞 鄂 燃 筑 荆 娥 纽 脐 流 式 细 胞 技 术 流 式 细 胞 技 术