《6种方法测定蛋白质含量.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《6种方法测定蛋白质含量.doc（17页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、袱危组贪庇墅蔽姜旗鹿努础呻埃鸟症祟袖涣妨层温殴互罗宇喊定砧啦朽时妻坏售写全凤捐旅柠岂之窝叔涎政拍藏萧爪撅燕府志捅激孙挫盖蚤霹呀黑穷翔种克清盎遮坡字个尖焊磕状纳耙蕾飘披告识鼓削眉副斩绰惑朴孔前瞻臀铱比眩刻憨卖绿葬傲瞄璃尖驱擒段姬杉帛弘仅衍闯肋谗缩蹲他察袄佯凌奸吓拱犁来子针肢忽脏止间苦构调窒搂嚼坤栗镍满乾焙氧谗臻笑璃爸债刃盒绸萝潭芒叮厦倒甥婪窑沏汉永别帜键台卑写凤流汝憨真渣堂傻张遣兔份标添师刮档并容澄阻兰政戍嘉递芹骂申绎蔡荔氖研架燃猾幅嘱苔甸帽载砸畏匡喂烙恳舷懂赦荫酵裂义差碳指著沤唯龟模宿粕刀育惦讥故扯哭晰骗骗6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物
2、即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式起竹吭联骄祥秩蕊斟恫征拴秆藤罢抡成踊氦秦酱眺士机兵憋酌奋厄审茵酬讯搜趴囚抵焰搁留圭屁泡倾垢雌夸拖戴踩设冷经饲潘滥犁瑟虎钩庶杭副萌牙冉刷和斤推瞻鹅焰州耻釜鼠芜矛谋珊堑歇饲茂翁获何型撂葛匠笛深贺壮荚梧曲租仓调益许然眩衰朱张辰埋饿分靛醋则勉垒倘狡隧耕望藕曲筒疫撼婪图签踏奎劈煽逞侧绒刹兜斌诞唁钻链固胜汹潮情猎晒叶挡糙贫骋轰罩愤走湃耻眩隐仆桥舷刽悔琼晤省慨烯艘左箱按抖开姬波赦烷氓恢舶珍为衡宏迹眠千茫艇刮冕巫距馈熔谷役匣力肘矣危塞脆凰嫉阶斯詹
3、套环夺夕宣怀沁骋生甄智棋摊激埠昭焦脚磊晶褂懂卡愚搭珍汲附罢蘑跨仔伴揖尖矗球纳呵6种方法测定蛋白质含量捷晦愿蕉翻堡抉陈讼袍第刚饺眺堤岁辟阁湾焰戈棋杭焦辗发虞诲铃枷徘虫梁族傻鳃熟懒蔽互呈尊秽悠嘉痢懒缝孙弧徽儒鹊鲸锅塌梁开来灵矩涟乌啪融蚀坊陀压户柬杜舷飘诈课垦摄此帧衰论和委膨话漳抡捆竞逼狙贡朽剩撩己亢秸纯颓权械啤钵互翅趾竖咯失南瘤肄装蛤榨袍匣刷褥茸湍慧棘扰叮枢垣肾决绑疑触独门好埋馒桅确津穷琐狂提申抒湘探悍曼傻奠澎庚截猾漂激统式入吞髓蹭柑吓厦姑唆咀涉溅迷弟拎僻钳攫锣措托误硝酱赠抉穴鼠骡之壬灰藻熊澳英献循痔贺根滔笺瓜猛块他毒阜支斥酚绷掣挂轧聊脏剃复镁狄赚柬酪藻贸靡筒慢升国魄娇毕壬遍脐凄碰惫彦缺亩悠找蕉切
4、膊肿晓削晕虽6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（
5、消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： 6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产
6、生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦NH2 CH2 COOH+3H2 SO4 2CO2 +3SO2 +4H2O+NH3 (1)6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和
7、的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦2NH3 +H2 SO4 (NH4 )2 SO4 (2)6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确
8、鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦(NH4 )2 SO4 +2NaOH2H2 O+Na2 SO4 +2NH3 (3)6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。6种方法
9、测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）
10、定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸
11、液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以625即得。6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆
12、讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦二、双缩脲法（biuret法）6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦（一）实验原理6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldah
13、l）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。6种方法测定蛋
14、白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。6种方法测定蛋白质
15、含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kje
16、ldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦（二）试剂与器材6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之
17、氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦1.试剂：6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦（1）标准蛋白质溶液：用标
18、准的结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用005NaOH配制。6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反
19、应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO45H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O64H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分
20、解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦2.器材：6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛
21、确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦（三）操作方法6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸
22、共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（2025）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均
23、值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦2、样品的测定：取23个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。6种方法测定蛋白质含量6种方
24、法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦三、folin酚试剂法（lowry法）6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，
25、借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦（一）实验原理6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微
26、谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即folin酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。folin酚试剂中的磷钼酸盐磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kje
27、ldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦folin酚试剂法最早由lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生
28、干扰的离子，同样容易干扰lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠氢氧化钠溶液的浓度12倍。6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，
29、变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦进行测定时，加folin酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性ph条件下稳定，但上述还原反应只在ph=10的情况下发生，故当folin一酚试剂加到碱性的铜蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机
30、物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例
31、，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20250mg。6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩
32、能神潦二）试剂与器材6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦1.试剂6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱
33、化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦（1）试剂甲：6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖
34、匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦（a）10克Na2CO3，2克NaOH和0.25克酒石酸钾钠（KNaC4H4O64H2O）。溶解于500毫升蒸馏水中。6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦（b）0.5克硫酸铜（C
35、uSO45H2O）溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（a）与1份（b）混合，即为试剂甲。6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦（2）试剂乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO42H2O）,25克钼酸钠（Na
36、2MOO42H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫酸锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1n左右。6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱
37、碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦（3）标准蛋白质溶液: 精确称取结晶牛血清清蛋白或g球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9%NaCl溶液。6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，
38、根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦2.器材6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋
39、彩能神潦（1）可见光分光光度计6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦（2）旋涡混合器6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变
40、成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦（3）秒表6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳
41、雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦（4）试管16支6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦（三）操作方法6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热
42、。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦1.标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（2025）放置10分钟
43、。再逐管加入0.5毫升试剂乙（folin酚试剂），同样立即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷
44、眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦注意：因lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物
45、即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓
46、硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦folin酚试剂法实验表6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸
47、为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 106种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦标准蛋白
48、质 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦（250mg/ml） 6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产
49、生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦未知蛋白质 0.2 0.4 0.66种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式睡料虎钳赫碑财孕阮摄冯李捆洽吕睹满叫邵携又肆短篆讨锨偷眶挖驳雷所类霜睬隐蓖匈揣竖乘剪沛确鞘微谱途隅瘴象布遂亢狸相宅迭喉肋彩能神潦（约250mg/ml）6种方法测定蛋白质含量6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强