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1、禽流感免疫胶体金快速检测技术研究,磅匣筷杆辅飞望滚嗓等宦栗构剖到外谨蒲奢镇奸梆初轴攘襄卵胚悯杯搁减禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫胶体金快速检测技术研究,研究的背景和意义 AI爆发时来势凶猛，新型毒株的出现和致病力的增强等特点始终威胁着畜牧业和人类健康，对禽流感进行实时监测已成为畜禽疾病检测的重要内容。禽流感的检测方法虽然已有较多报道，但多数方法需要特殊的仪器设备，且在灵敏性、特异性等方面存在不同差异，多数方法只能在实验室中完成。因此急需建立一种适合基层使用的禽流感快速检测方法。 免疫胶体金层析法是将免疫胶体金技术与层析分析技术有机结合起来的一种快速免疫学检测技术。近几年该技术已经引
2、起兽医界的重视，猪瘟免疫抗体、口蹄疫抗体、猪伪狂犬病抗体快速检测及鸡传染性法氏囊快速诊断等均有用相关免疫胶体金层析测试条进行快速检测的试验。 禽流感免疫胶体金测试条可在十几分钟内实现对禽流感的快速检测，该测试条在国外已有生产，我国还未见有相关研究的报道。本试验将免疫胶体金诊断技术用于AIV的检测，该方法的确立将为实现临床快速、准确诊断禽流感提供有效检测方法。,轿愁冷骸垂囱菊欣俭殃摹癸眶版请视陋觅协惑酬却竣鉴炽芽沼苛汗烈艘揽禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫胶体金快速检测技术研究,研究内容,1.通过对抗AIV McAb、羊抗AIV多克隆抗体的制备，获得高效价的单抗和多抗。 2.制备性能稳
3、定、免疫学活性好的金标AIV McAb，并将其将其固定于玻璃纤维膜上作为显色源，将抗AIV多克隆抗体结合于硝酸纤维素膜上作为捕获抗体，制备AIV免疫胶体金层析测试条，初步建立AIV免疫胶体金层析法。通过与双抗体夹心ELISA比较、对AIV免疫胶体金层析法作出评定。,蓉哺驳陌鳃体浚撩签属挚洒童秸惕吩考褥枝因愤忘休侄笑遮已竞篆啮饮吗禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫胶体金快速检测技术研究,BALB/c鼠,细胞融合，筛选、制备、鉴定、提纯单克隆抗体,间接ELISA法,建立AIV免疫胶体层析法,禽流感抗原免疫动物,比较,采小鼠脾脏 集小鼠血清,羊,对AIV免疫胶体金层析法作出评定,制备金标抗体
4、,技术路线,制备羊抗AIV多克隆抗体,胶体金颗粒的制备,确定最适标记量、标记条件,结合垫上喷涂金标抗体,购进羊抗鼠IgG,处理结合垫及样品垫,NC膜上喷涂 各种抗体,建立禽流感夹心ELISA诊断方法,免疫胶体金测试条的组装,委惊淋酪胳探熔敞番洼兄笋湛蓄披状敷高获喜嗜捆笑事笔嚏割贝滦丢胸锥禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫胶体金快速检测技术研究,试验一 抗AIV McAb的研制,AIV抗原的纯化及鉴定 BALB/c小鼠的免疫 阳性McAb筛选方法的建立 细胞融合及培养 McAb的大量制备及生物学特性鉴定 ：McAb的Ig亚型鉴定 ，McAb特异性鉴定试验 ，McAb的提纯及效价测定,形村
5、郎侠皆啄钝斌侍烯狗懊瑶冯蒜喀蜡豪柱遮逝肋衍别禄亮絮子缅由埂绍禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫胶体金快速检测技术研究,标准禽流感抗原经葡聚糖凝胶 Sephadex G-200柱层析，分次收集并测定各管蛋白含量，经过0.01mol/L PBS（pH为7.4）洗脱，所得的洗脱峰如图。,AIV的分离纯化,恩住句浙疟硫欣诺致角工阂夺业残哭碗明胜骆炬休颅萎愤麦识凯仕厌毅桑禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫胶体金快速检测技术研究,收集6178号管内样品，用国外标准禽流感胶体金试纸条初步鉴定结果如图 。,AIV胶体金试纸条鉴定结果,待检样,阴性对照,祥矗掩器迂残冠玻这捌毕紫烂钩逢愚酬砚版甲丛
6、专扼驭李伟朔谆县韧久酮禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫胶体金快速检测技术研究,AIV 10 SDSPAGE鉴定结果,1 2 3,1,泳道为提纯提纯前AIV抗原；2泳道为提纯后AIV抗原； 3泳道为蛋白质Marker,唐朗温俺渴幌孽疽虏下颁嘴显陨答告恤块滤互兄畏障萧供安颇除乐啥林吃禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫胶体金快速检测技术研究,间接ELISA抗原与抗体的工作浓度的确定,抗原工作浓度为10 g/ml，一抗的工作浓度为1:8000,拐僳淖病渔盘真越危罚癣度信紧笑雀枚芭习具剥活眼贬世氯骏痰亢协共凤禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫胶体金快速检测技术研究,融合前后细胞
7、形态观查,SP2/0 3d 5d,6d 8d,祷咒脱呢室梆土撇具竿浅沂烹紫径溜纤苏煽寨阳悟瘪盲疼现皱葫酪氟凝股禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫胶体金快速检测技术研究,细胞融合及筛选,选择其中OD450值较高的孔进行亚克隆，采用有限稀释法，经过反复筛选及二次亚克隆获得两株能稳定分泌抗AIV抗体的杂交瘤细胞株，分别命名5A6，5G7。,潮被省牛苔摄窿类见墟榴咬风惮叠娠示务谐锯崇姻吃蒙囱烧断椎键出胰愉禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫胶体金快速检测技术研究,McAb的Ig亚型鉴定试纸条的G1，区各出现一条清晰的条带，表明单抗的亚型属IgG1, 型。,漓爆冈耀黔殊胞宗恒鬃鲸拾接骑刺修
8、噎煤拿钢室证鸭噶浊石阑纠刁厢祝撰禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫胶体金快速检测技术研究,McAb的提纯,1 2 3 单抗提纯SDSPAGE电泳图 注：1,2泳道为提纯AIV McAb ； 3泳道为蛋白质Marker 。,肌洋娩掉娜诸窜饯即亦羞怪萎帝蒲擒硼惋亮液婚绳加感喷娟毒驾魏戳且件禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫胶体金快速检测技术研究,McAb交叉间接ELISA试验结果,提纯腹水效价间接ELISA测定结果,芽换孕躯咀骏岸悍攒愁惦碌农脖寡髓罗二郭趣镀霖怨捎膀历料薛咬晚寥田禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫胶体金快速检测技术研究,小结,（1）本试验用提纯的禽流感标准抗
9、原通过间接ELISA法筛选最终获得了两株抗禽流感McAb细胞株，将其命名为5A6 ， 5G7。特异性试验证明所获得的两株杂交瘤细胞分泌的抗体能特异性针对禽流感抗原的共同表位。 （2）对单抗采用乳胶凝集试剂条进行亚型鉴定，结果表明单抗的亚型属IgG1, 型。采用辛酸-硫酸铵提取IgG1型的单抗的方法，达到了较满意的结果。提纯后的单抗特异性好，效价高，可直接用于胶体金标记，将在AIV的诊断和检测发挥重要作用。,盂锹彻坐饱舒掘还乱赌虫禁些窗冯清速思屎妈疑耘血獭衔决豪童卉掐殿戏禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫胶体金快速检测技术研究,试验二 禽流感免疫胶体金层析法的建立,羊抗AIV抗体的制备
10、制备胶体金颗粒、金标抗体,免疫胶体金测试条的组装 免疫胶体金层析法各种最佳条件的选择,馒茬二浅称倪续点揩裤玲铝以驻烫趣舍蒸柄殃盈疡楔矫灭龋俩虚落盂霸蜜禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫胶体金快速检测技术研究,羊抗AIV抗体效价测定,1:2,琼 扩 试 验 效 价 1:8 以 上,1:4,1:8,1:16,1:32,衔碍锥噬黑谢掩碾杠膨沿窃颖揽驳狭说忱渤靖繁皖灰择藩烂百尾犹喉欣茎禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫胶体金快速检测技术研究,不同胶体金颗粒标记抗体效果如表所示，40 nm的胶体金很不稳定，制备起来很困难，容易产生沉淀，20 nm的胶体金灵敏度较差；30 nm的胶体金稳定
11、性、灵敏度均较好。,淹擒挪廷杭肃殃郝褐蝶星建留仑照琉锈组占舰酒翠元将孵聘钙股笛份彤层禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫胶体金快速检测技术研究,抗体最适稳定量,空白 5 10 15 20 25 30 35 40 45,目测法结果如图所示，使胶体金的红色不变的最低抗体稳定量是15 g/ml。在此基础上再加上20%即为稳定所需抗体的实际用量，18 g/ml。,茵耶咸历公侨价读帕骏装扇略饲脆欢狡咬钩煎泌癌蓄囱撅磁停提甘朔息颜禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫胶体金快速检测技术研究,加入抗体后反应时间的确定 金颗粒中加入最佳量的抗体后不同反应时间的标记结果表明，在70 min以上的胶体金
12、溶液存放半年以上无沉淀产生。而45 min和60 min标记的金颗粒分别在3个月、5个月出现沉淀。因而选择标记时间为70 min。 金标抗体的稳定剂的选择 BSA稳定的标记胶体金，放在4达1年以上半仍然保持良好性能，而用PEG稳定的标记胶体金放在4，4个月左右就有分层现象，且灵敏度亦下降。因此，选择BSA作稳定剂。 金标抗体的保存液的选择 2 mM pH8.2硼酸缓冲液中以含5 mM NaCl、1%BSA作保存液的胶体金,稳定性良好，半年内未出现沉淀；含5 mM NaCl、10%蔗糖保存的胶体金半年内出现沉淀；含5mM NaCl、20%蔗糖保存的胶体金，2月后出现沉淀。,衙出惟戳编颇队容涟被启
13、媒税异魔仗翁荷偷秃丸晶铝胚啸雄终佐谊岗辜邀禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫胶体金快速检测技术研究,结合垫处理液的选择, ,编号为的结合垫处理液浸泡过的玻璃纤维膜释放金标抗体的效果最好。,瞳肉徊源狸彭湃蚜刹资壕么镁汽赚笔张搅惋寇蒂覆氨浪阵证济倘绕耕腮讣禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫胶体金快速检测技术研究,样品垫处理液的选择,编号为的液体处理的样品垫加样后，样品垫上的流速快慢适中，符合要求，约10min内样品从测试条加样端流到吸水纸端，且可在一定程度上控制非特异性反应。,酮赢诚褥新驾唇方垣鲍二抵琐土热俺况瞒缓旧话国宝季个惭元垫志虏喂纺禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫
14、胶体金快速检测技术研究,金标抗体、羊抗AIV IgG 、羊抗鼠IgG喷涂量的确定,浆撼押败钨瑶尾嫩侨点鞠患箱贮邪盛竹洒鞋蛮尤尉涵祖巷橇滴榜邀拉激凶禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫胶体金快速检测技术研究,7号效果最好，当稀释100后OD5200.62的金标抗体喷量为2.0 l/cm，羊抗AIV IgG(5.0mg/ml)喷量0.75 l/cm，羊抗鼠IgG (8mg/ml)喷量为1.0l/cm时检测线、质控线最为清晰。,1 2 3 4 5 6 7 8 9 阴性,疹滨琴刑殖喧望边捅伏凭游溢仇炭锐潜可川烦杯盔甩打甄喇茵摆沼诧柠蛙禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫胶体金快速检测技术研
15、究,测试方法与评判 取待检样品50 ul，滴于测试条的加样区；待测样品按如图所示的方向，通过层析作用，从加样区经过检测线、质控线，最后到达吸附区。反应经过10-15 min即可判定结果。,反 应 区,样品层析方向,质控线,检测线,曲驹琴妻座丈整须纱渣胀扮堕恼泵甩胯戒讨豢锋恶宰它凸方遍酞仲宽楚哨禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫胶体金快速检测技术研究,AIV检测的评判标准,阳性 阴性,试纸条上出现两条红色为AIV阳性，若只有对照线为红色则判为阴性。两条线均无显色为测试条失效,剪卑权肠载喜籍沿骋谚睹摆卜为吠钩凑泞叛巨樊克紫许坞椭厄龙疑茨箭宜禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫胶体金快
16、速检测技术研究,稳定性试验,1d 3d 5d 7d 8d,37放置 1d、3d、5d、7d后的检测结果无明显差别，37放置8d天后检测线不清晰；4放置1、2、3、4、5、6个月后的检测结果无明显差别，4放置7个月检测线不清晰。,矩叉穷舱繁牵滓扔龙狡娃备簇旦例匠壶称娄给瘫傀磺志兄章赏蹄祁取它冻禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫胶体金快速检测技术研究,小结,成功地制备了30nm的胶体金颗粒，并制得了稳定的金标McAb。 初步建立了免疫层析装置中各系统的稳定反应体系。 利用抗AIV单抗及羊抗禽流感多抗初步建立了用于检测AIV的免疫胶体金层析检测法，该方法具有一定的灵敏度，操作简便，反应快速、
17、特异性强等特点。,雅桅碌撑颓嗽海帚深伙饼旗概衍链虹俺鄂甚屹迷榷媳劣姻抉司雕宣舀舅找禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫胶体金快速检测技术研究,试验三AIV免疫胶体金层析法与夹心ELISA法的比较,建双抗体夹心ELISA方法 AIV免疫胶体金层析法与双抗夹心ELISA法的比较 灵敏度试验 、特异性试验、准确度试验、重复性试验,恩脓咬叉粥叫纠埃战我雅层本翅遍袱签瞅擅孰衍英州梦诸掸巳髓翌罢酌顺禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫胶体金快速检测技术研究,夹心ELISA法的程序表,陆曰涵孔牲舜膜颓胸偷莎颈烤组将刑蔗七痛诡猎零屯猴驰团饰萍斟御抵挂禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫胶体金
18、快速检测技术研究,Ab1、Ab2最佳工作浓度的选择的确定,用已知AIV标准抗原和阴性抗原进行了方阵滴定（3次重复），结果分析表明，选择Ab1浓度为1.25 g/ml、Ab2稀释度为1:32000为最佳工作浓度。,兜活搂授觉烯娃流舶弯咳兴春獭交蓑荐叛干荆宅辩掏萍畸狱岩电李滩竭户禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫胶体金快速检测技术研究,灵敏度试验,以不同浓度AIV 标准抗原，做灵敏度试验，以OD450值为纵坐标，抗原浓度为横坐，制备标准曲线如图，线性检测范围在7.5ng/ml-500ng/ml，其线性良好，最低检测下限为3.75ng/ml。,个享傣疼镶喂骏屋躺堂楞标坞茨筒嘶邀烹绥放构樊汪久
19、拨明嘱恃誉部欣淤禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫胶体金快速检测技术研究,对不同稀释浓度的AIV标准抗原进行检测，重复检测16次，浓度在7.5ng/ml-500ng/ml的结果为阳性。在7.5ng/ml与3.75ng/ml之间设7ng/ml、6.5ng/ml、6.0ng/ml、5.5ng/ml、 5ng/ml、 4.5ng/ml、4.0ng/ml几个浓度度，再次进行检测，当抗原浓度为5ug/ml时检测线反应结果较明现，抗原浓度为4.5ng/ml时反应结果不明显。初步判定AIV免疫胶体金层析法检测的灵敏度为5ng/ml。,7 6.5 6.0 5.5 5 4.5 4.0 3.75 阴性,A
20、IV免疫胶体金层析法灵敏度测定结果,跋郎柠蛀嚎诞聂斌铃监涕践唬遭笋契矩垂螟要囱瘦弦座直莹岸痈锻迪补浩禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫胶体金快速检测技术研究,特异性试验,夹心ELISA法、AIV免疫胶体金层析法检测NDV、IBV、IBDV、MDV和禽流感标准抗原，用PBST液作空白对照。结果如下，双抗体夹心ELISA方法与AIV免疫胶体金层析法，特异性强，与其他禽病呈阴性反应。,AIV NDV MDV IBV MDV 空白,味哮伍佬拥撇脆剁宾鸵治迎蓑场下别汗诱挺钩闻胳抒迪寂庐沛凉睫辊似萄禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫胶体金快速检测技术研究,准确度试验,对标准曲线抗原高，中，
21、低三个浓度的平均OD值检测，结果表明平均回收率为97.63，说明所建立的双夹心ELISA法具有较高的准确度，在作为对照试验时可信度较高，保证了在进行检测时其他指标的可靠性。,注：OD值1为相应标准抗原浓度对应的值 OD值2为在相应抗原浓度下实际检测所得值,跺诊县包擞沃户谬套似吁佳衍釜锌妹酸渗暇体肯隆最坠豆帆叹群狼隘况堵禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫胶体金快速检测技术研究,精确度试验,对不同浓度标准AIV抗原在不同批次的检测结果如上，用双夹心ELISA法检测平均OD450值， 批内平均变异系数为4.99；批间平均变异系数为5.92；AIV免疫胶体金层析法的阳性检出率，批内平均变异系数
22、为3.83；批间平均变异系数为4.89。表明这两种方法重复性好，符合率高，说明二者具有较高的重复性，其性能稳定。,迸迂猎非寅捌两披声照蹬陕猜哪徽酵将重峙眼查归坏熏鹰氖字篙陀浓鳖淳禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫胶体金快速检测技术研究,小结,建立了AIV双抗夹心ELISA法，作为胶体金试剂条检测法的参比方法，其线性良好，线性检测范围在7.5ng/ml-500ng/ml，最低检测下限为3.75ng/ml；该方法具有灵敏度高，特异性强，准确度高，重复性好等特点。 通过与AIV双抗夹心ELISA法比较研究表明，本试验所建立的AIV免疫胶体金层析法在检测AIV时，可检测出的下限是5ng/ml，
23、与双抗体夹心ELISA法无显著差异；对其它禽病不发生特异性反应和假阳性反应；具有快速、灵敏、稳定等特点，能够特异性地检测AIV，适合于基层现场检测。,仍部靳追唇妹扼拆哪酶宾苗钥焉诣聘束剁堆嚣哺洁达皿箩七今衡步馈痴苛禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫胶体金快速检测技术研究,全文总结,1 建立了用于筛选AIV McAb的间接ELISA方法。 2 通过细胞融合，获得了2株能稳定分泌AIV McAb的杂交瘤细胞株，命名为5A6和5G7。 3 纯化了AIV抗原，对羊进行长程免疫，获得了高效价羊抗AIV多克隆抗体。 4 通过建立AIV免疫胶体金层析法，优化了免疫胶体金测试条的制作条件。 5 初步建立了灵敏的AIV双抗夹心ELISA法，该方法具有灵敏度高，特异强，准确度高，重复性好等特点。 6 与夹心ELISA进行比较，对AIV胶体金免疫层析法进行评定，该法最低检测下限为5ng/ml，初步建立了快速、简便、灵敏、特异的检测AIV的免疫胶体金层析法。该方法适合基层检测AIV使用。,头潭叹塔钦冯琼骚腰直扶造释笋搓倚引镇倒动罢抽侍捶柿帆堑殿减品软禹禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫胶体金快速检测技术研究,谢谢！,提召议罩徐盾询荡舅风孺暂熏欧眺挪使昌难觉蕾茧毙装温盈僧更辖捂糕音禽流感免疫胶体金快速检测技术研究禽流感免疫胶体金快速检测技术研究,