1、色谱法色谱法常用仪器分析（常用仪器分析（2）色谱法及其应用色谱法及其应用色谱法色谱法一、一、来历来历二、二、色谱原理色谱原理1、色谱过程和基本术语色谱过程和基本术语2、色谱分离的条件色谱分离的条件 差速迁移差速迁移 分配分配系数系数三、三、色谱法分类色谱法分类1、按作用机理按作用机理2、按流动相的物态按流动相的物态3、按固定相载体形式按固定相载体形式薄层色谱法薄层色谱法 1、分离过程分离过程2、固定相（吸附剂）固定相（吸附剂）3、流动相（展开剂）流动相（展开剂）4、分离效率分离效率5、检测方法检测方法6、实用意义实用意义气相色谱法气相色谱法1、色谱过程、色谱过程 2、色谱图及术语、色谱图及术语
2、 3、分离度、分离度 4、色谱柱和固定相、色谱柱和固定相 5、检测器、检测器 色色 质联用质联用 6、分析方法、分析方法 7、实用意义、实用意义高效液相色谱法高效液相色谱法 1、色谱过程色谱过程2、种类种类3、固定相和流动相固定相和流动相4、检测器检测器5、实用意义实用意义色谱分类及要点色谱分类及要点1903年俄国植物学家年俄国植物学家 茨威特（茨威特（M.C.）在研究植物中色素时，首先采用色在研究植物中色素时，首先采用色谱分离手段成功分离了混合色素，并对谱分离手段成功分离了混合色素，并对色谱分离方法进行了阐述。色谱分离方法进行了阐述。色谱原理色谱原理1、色谱过程及术语、色谱过程及术语经典的柱
3、式色谱过程：经典的柱式色谱过程：将一种具吸附性的将一种具吸附性的固体粉末状物质填状到固体粉末状物质填状到一根玻璃管中，然后将一根玻璃管中，然后将需要分离的样品溶液注需要分离的样品溶液注入到玻璃柱中，再以某入到玻璃柱中，再以某种溶剂连续不断地冲洗种溶剂连续不断地冲洗柱子，使样品溶液中的柱子，使样品溶液中的成分在随溶剂移动的过成分在随溶剂移动的过程中得以分离。程中得以分离。固定相固定相 (stationary phase)填装在填装在玻璃管中的固体粉末物质。玻璃管中的固体粉末物质。色谱柱色谱柱 (column)装有固定相的玻璃装有固定相的玻璃管。管。流动相流动相 (mobile phase)又称又
4、称洗脱剂洗脱剂(eluente)在分离过程中，保持以在分离过程中，保持以 一个一个方向通过色谱柱的溶剂。方向通过色谱柱的溶剂。洗洗 脱脱（elution）又称）又称“淋洗淋洗”，即流动相通，即流动相通过固定相的过程。过固定相的过程。洗脱物洗脱物 (elute)通过固定相后流出色谱柱的溶通过固定相后流出色谱柱的溶液。液。色谱图（色谱图（chromatogram）是由组分在柱中的浓）是由组分在柱中的浓度与流出时间作图形成的曲线。度与流出时间作图形成的曲线。2、色谱分离条件、色谱分离条件差速迁移差速迁移(differential migration)*样品中的各种组分，在流动相的带样品中的各种组分，
5、在流动相的带动下，以不同的速度在固定相中移动，动下，以不同的速度在固定相中移动，称差速迁移。称差速迁移。*差速迁移是色谱法分离混合物的基本差速迁移是色谱法分离混合物的基本条件。条件。分配系数分配系数 (partition coefficient,distribution coefficient,K)两个组分两个组分在固定相中是在固定相中是否能产生差速否能产生差速迁移取决于两迁移取决于两者分配系数的者分配系数的差异。差异。*在一定条件下，分配系数是化合物的特在一定条件下，分配系数是化合物的特 性常数。不同的化合物分配系数可不同性常数。不同的化合物分配系数可不同.*K值越大，移动的速度越慢；反之，
6、移值越大，移动的速度越慢；反之，移 动速度越快。动速度越快。*两种化合物的两种化合物的K值差越大，差速迁移越值差越大，差速迁移越 明显，越易被分开。明显，越易被分开。保留参数保留参数（retentionparameter）保留参数间的关系及色谱峰不同高处的峰宽保留时间（保留时间（retention time，tR）死时间（死时间（void time，t0）容量因子容量因子（capacity factor，k）容量因子根据分配平衡定义的容量因子为：一定温度下，根据分配平衡定义的容量因子为：一定温度下，组分在两相间的分配达到平衡时，其在两相中组分在两相间的分配达到平衡时，其在两相中的绝对量之比：的
7、绝对量之比：根据保留参数定义的容量因子为：组分根据保留参数定义的容量因子为：组分在固定相中的净保留时间与死时间的比：在固定相中的净保留时间与死时间的比：或或 tR=t0（k+1）理论塔板概念理论塔板概念（theoreticalplateconcept）两个组分被分离的条件首先是它们有不同的KD值或 k值，但也与峰的形状和宽度有关色谱峰宽与保留色谱峰宽与保留 t/min为了描述色谱峰的宽度，引入理论塔板数为了描述色谱峰的宽度，引入理论塔板数（n n）的概念。用统计学的方法对理论塔板数）的概念。用统计学的方法对理论塔板数定义为定义为2 2 和和2 2 分别表示色谱分别表示色谱峰的均值（峰的均值（m
8、eanmean）标准差（标准差（variancevariance）大，峰矮、宽，组分在分离过程中大，峰矮、宽，组分在分离过程中扩散作用较强；扩散作用较强；小，峰高、窄，分离过程中聚集作小，峰高、窄，分离过程中聚集作用较强。用较强。n值反映色谱过程的总体聚集趋势和值反映色谱过程的总体聚集趋势和扩散程度，色谱的重要参数。扩散程度，色谱的重要参数。在实际应用中在实际应用中其中其中,W 1/2 为色谱峰的半峰宽，为色谱峰的半峰宽，W b 为峰为峰底宽，底宽，h为峰高为峰高理论塔板数与柱长（理论塔板数与柱长（column lengthen，L）成正比。所以，柱的性能还可用塔板高度成正比。所以，柱的性能还
9、可用塔板高度（plate height,H）来表示，即：）来表示，即：理论塔板概念被广泛理论塔板概念被广泛用来描述色谱柱的特用来描述色谱柱的特性，性能良好的色谱性，性能良好的色谱柱，其理论塔板数高，柱，其理论塔板数高，塔板高度值小，峰形塔板高度值小，峰形窄而对称窄而对称范氏方程范氏方程（VanDeemterequation）1956年，年，Van Deemter提出了色谱中塔板高度提出了色谱中塔板高度受三方面的因素影响，并总结出了与流动相线受三方面的因素影响，并总结出了与流动相线速（速（u）有关的经验表达式称为范氏方程）有关的经验表达式称为范氏方程1涡流扩散项（涡流扩散项（A）A与固定相的粒度
10、大小和与固定相的粒度大小和均匀度有关，与流动相的性质无关。气相色谱中均匀度有关，与流动相的性质无关。气相色谱中使用空心毛细管柱使用空心毛细管柱(又称空心柱又称空心柱)时，由于无填充时，由于无填充颗粒，颗粒，A项为零。项为零。2分子扩散项（分子扩散项（B/u）与组分在柱中的浓度梯与组分在柱中的浓度梯度和分子的扩散运动有关，增加流速有利于克服度和分子的扩散运动有关，增加流速有利于克服由由B/u项引起的色谱峰展宽。气相色谱中，项引起的色谱峰展宽。气相色谱中，B/u项是色谱峰展宽的主要因素；而液相色谱中，由项是色谱峰展宽的主要因素；而液相色谱中，由于液态分子的扩散运动较低，于液态分子的扩散运动较低，B
11、/u项可以忽略不项可以忽略不计。计。3传质阻力项（传质阻力项（Cu）与固定相的液层厚度和）与固定相的液层厚度和柱中流动相的迁移速度有关。组分进入固定相柱中流动相的迁移速度有关。组分进入固定相和从固定相返回流动相均需要一定的时间，所和从固定相返回流动相均需要一定的时间，所以增加流速将会造成分子质量迁移速度的差异，以增加流速将会造成分子质量迁移速度的差异，而引起色谱峰展宽。液相色谱中，而引起色谱峰展宽。液相色谱中，Cu项是色谱项是色谱峰展宽的主要因素。峰展宽的主要因素。分离度分离度（resolution，Rs）在给定色谱条件下，相邻的两个色谱峰被分离的程度用分离度来表示为：薄层色谱法薄层色谱法(薄
12、层层析法薄层层析法)thinlayerchromatography,TLCTLC是一种板式液相色谱，以吸附剂为是一种板式液相色谱，以吸附剂为固定相，混合溶剂为流动相。固定相，混合溶剂为流动相。1、分离过程及术语、分离过程及术语铺板铺板将固定相材料均匀将固定相材料均匀地铺在玻璃或其地铺在玻璃或其他材料的底板上，制成薄层板。他材料的底板上，制成薄层板。原点原点将需分离的样品溶液点加在薄层板将需分离的样品溶液点加在薄层板的的一端，成为一个小一端，成为一个小圆点。圆点。展开展开(development)使点有试样的薄层使点有试样的薄层板一端与适量流动相接触，借助毛细管板一端与适量流动相接触，借助毛细管
13、作用力使流动相在薄层板上依次湿透前作用力使流动相在薄层板上依次湿透前移，经过原点时带动样品组分向前移动。移，经过原点时带动样品组分向前移动。经过一定时间后，分配系数不同的组分经过一定时间后，分配系数不同的组分因迁移速度不同，在薄层板上移动的距因迁移速度不同，在薄层板上移动的距离不同，因此得以分离。离不同，因此得以分离。比移值（比移值（Rf值）值）组分展开后的斑点组分展开后的斑点中心至原点线的距中心至原点线的距离与流动相前沿至离与流动相前沿至原点线距离的比值。原点线距离的比值。RfA=a/cRfB=b/c比移值是鉴别不比移值是鉴别不同化合物的依据。同化合物的依据。固定相（吸附剂固定相（吸附剂ad
14、sorbent）种类种类硅胶、三氧化二铝、聚酰胺等吸附硅胶、三氧化二铝、聚酰胺等吸附剂又以硅胶最为常用。剂又以硅胶最为常用。粒度粒度颗粒的大小可影响分离的效果和颗粒的大小可影响分离的效果和展开展开速度等。颗粒越小，其表面积越大，速度等。颗粒越小，其表面积越大，活性位点越多，吸附力越强；颗粒过细活性位点越多，吸附力越强；颗粒过细会延长展开时间，加重斑点扩散，影响会延长展开时间，加重斑点扩散，影响分离效果。颗粒不均匀可使斑点分离效果。颗粒不均匀可使斑点变形、变形、拖尾，影响分离效果。拖尾，影响分离效果。孔径孔径大小适度且均匀，可提高重现性。大小适度且均匀，可提高重现性。活度活度一种用以判别吸附剂吸
15、附力强弱一种用以判别吸附剂吸附力强弱的参数。活度越大，吸附力越强。活度的参数。活度越大，吸附力越强。活度可通过水分多少来调节。一般分离弱极可通过水分多少来调节。一般分离弱极性化合物时应用较大活度；分离极性化性化合物时应用较大活度；分离极性化合物时，活度不宜过高，否则易导致拖合物时，活度不宜过高，否则易导致拖尾。尾。酸碱性酸碱性硅胶具有弱酸性；三氧化二铝可因处理硅胶具有弱酸性；三氧化二铝可因处理不同而具有酸性、中性和碱性。不同而具有酸性、中性和碱性。酸碱性可影响对具酸碱性的化合物的分酸碱性可影响对具酸碱性的化合物的分离效果。离效果。3、流动相、流动相(展开剂展开剂developer)种类种类多以
16、两种或两种以上不同极性的溶多以两种或两种以上不同极性的溶剂按照一定比列混合制成具有不同极性剂按照一定比列混合制成具有不同极性和不同选择性的流动相。可选范围较吸和不同选择性的流动相。可选范围较吸附剂大得多附剂大得多.选择方法选择方法A.相似相溶原则相似相溶原则一般来讲一般来讲,溶质在与溶质在与其结构相似的溶剂中溶解度较大其结构相似的溶剂中溶解度较大.好的展好的展开剂应对被分离的物质有适中的溶解度开剂应对被分离的物质有适中的溶解度,使使Rf值大小合适值大小合适,过大或过小都不利于分过大或过小都不利于分离离.B.转动三角形法转动三角形法反映组分、吸附剂和展开剂三者极性反映组分、吸附剂和展开剂三者极性之间的关系。之间的关系。法医毒物学筛查毛细管区带电泳（CZE）如何工作：毛细管电泳：就是在毛细管中进行的电泳法医毒物学中最常用的毛细管尺寸为：75mx50cm。如右图所示。20-200m5-100cm.+-谢谢！谢谢！
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