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1、猪细小病毒SYBR Green I荧光定量PCR诊断试剂盒的研制-农学论文猪细小病毒SYBR Green I荧光定量PCR诊断试剂盒的研制 余 波，周思旋，谭诗文，徐景峨，史开志，杨 莉 （贵州省畜牧兽医研究所，贵阳 ） 摘要：根据中猪细小病毒基因序列设计特异性的引物，扩增获得猪细小病毒基因片段，并克隆到载体上作为阳性标准品。通过对 荧光定量反应条件的优化，建立了猪细小病毒的 荧光定量诊断方法，以此为基础研制出试剂盒。试剂盒扩增产物的熔解曲线分析只出现个单特异峰，无引物二聚体，对、均无阳性信号扩增，可重复性好，测灵敏度可达拷贝。结果表明，研制的猪细小病毒 实时荧光定量试剂盒具有特异、灵敏、快速
2、、重复性好等优点，适合于猪细小病毒临床样品的检测。 关键词：猪细小病毒；基因； 荧光定量 中图分类号：文献标识码：文章编号：（）1264 ：33 Developing ng ， ， w， ， ， （ ， ， ） ： Based on ， ing ， ly ng . N . N ， ， ， ， with to It is ， . I ： ； ； g q 收稿日期： 基金项目：贵州省农业攻关项目黔科合字（）；贵州省畜禽健康养殖技术创新能力建设项目黔科合院所创能（） 作者简介：余 波（），男，四川邻水人，副研究员，硕士，主要从事兽医分子生物学研究，（电话）（电子信箱）； 通信作者，谭诗文（），男，研
3、究员，主要从事兽医分子生物学研究，（电子信箱）。 猪细小病毒（ ，）是引起母猪繁殖障碍性疾病的主要病原体之一，可导致母猪流产、死胎，给养猪业造成了巨大的经济损失。目前，对该病的诊断方法包括传统的病毒分离鉴定，以及血清学诊断方法，如、胶体金等。常规的主要用于病死猪组织样本的检测，然而常呈长期低剂量隐性感染，常规的不仅无法对血清样本中的病毒进行定量检测，而且扩增反应后需要电泳检测，操作繁琐。荧光定量是与常规比较，具有重复性好、灵敏度高、能够定量等优点，已经被广泛应用于多种疾病病原的检测，。本研究根据中猪细小病毒基因序列设计特异性的引物，利用技术扩增获得猪细小病毒基因片段，并克隆到载体上作为阳性标准
4、品。通过对 荧光定量反应条件的优化，研制出猪细小病毒的 荧光定量诊断试剂盒，为猪细小病毒临床样品的检测提供科学的诊断方法。 材料与方法 试验材料 菌株：强毒株、闽株、猪源大肠杆菌由贵州省畜禽疫病研究实验室保存。 主要试剂及仪器：、 （）及相应 、，、 荧光定量酶等购自宝生物（大连）工程有限公司；病毒基因组提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司。荧光定量仪为 实时荧光定量仪。 试验方法 引物设计 根据中猪细小病毒基因序列设计对特异性引物，上游引物： ，下游引物：，引物由宝生物（大连）工程有限公司合成。 病毒核酸的提取 ）组织样品：取待检样品淋巴结组织样品共约 ，加入 缓冲液，待
5、检样品研磨后 反复冻融次， 离心取上清液用于核酸的提取。病毒的提取参照病毒基因组提取试剂盒说明书进行，将提取的于 保存。猪大肠杆菌参照细菌基因组提取试剂盒说明书进行，将提取的 保存。 ）血清样品：取 血清加入等体积的血清裂解缓冲液 （ ）， ， ， ，混匀后煮沸 ， 离心取上清液 用于荧光定量和普通。 阳性标准品的制备 用“”中的引物，对 进行扩增，反应条件为： ； ，退火温度 ， ，个循环；最后 延伸 。将扩增的 产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收片段，与T克隆载体连接，转化感受态细胞，重组体命名为，同时送宝生物工程（大连）有限公司测序。用紫外分光光度计测定测序正确的重组质粒在 处的吸光度，得到
6、重组质粒的浓度和纯度，进行倍梯度倍比稀释，作为阳性标准品。 荧光定量反应条件的优化 荧光定量反应在 反应体系中进行，对荧光定量反应条件，包括退火温度（、 ），引物浓度（、 ），进行优化以确定最佳反应条件。上下游引物（、 ）各 ， - ， ，模板 ，用超纯水补足至 ，同时以超纯水作为空白对照。反应条件为： ； ，退火温度（ 、 、 ） ， ，个循环。 荧光定量反应标准曲线的建立 用紫外分光光度计测定测序正确的重组质粒，计算出重组质粒的浓度和纯度，计算拷贝数，随后将标准阳性样本进行连续倍系列稀释，以“”的条件进行扩增，每个稀释倍数个重复，以拷贝数为横坐标，以值为纵坐标建立标准曲线。 敏感性试验 将
7、重组质粒计算拷贝数后，进行倍比稀释后分别进行荧光定量反应，每个稀释倍数个重复，以确定建立的荧光定量诊断的敏感性。 特异性试验 以、 、 进行荧光定量反应，每个样品个重复，以确定建立的荧光定量诊断方法的特异性。 重复性试验 应用建立的荧光定量方法重复检测 样品次，以检验结果的可靠性。 试剂盒的组装与保存期检测 应用建立的荧光定量组装成试剂盒。试剂盒组成：荧光定量反应混合液； ；引物；阴性对照；阳性对照；去离子水；裂解液。将试剂盒各组份分别保存于室温、 和 ，设置周、个月、年3个时间梯度，对阳性菌株进行检测。 荧光定量试剂盒对临床样品的检测 对年贵州省贵阳市、黔西南、遵义、黔南州、铜仁地区几个生猪
8、养殖场和养殖专业户采集的份疑似病料，头份发病猪场未发病猪血清，应用研制的试剂盒进行检测，同时应用文献中的方法进行普通。 结果与分析 阳性标准品的制备 用“”中的引物，对 进行扩增，能有效扩增出了目的片段，片段大小为 ，无非特异性片段产生（图）。将宝生物（大连）工程有限公司测序结果与中的-基因序列比对，核苷酸相似度为。 荧光定量反应条件的优化 荧光定量反应在 反应体系中最佳反应条件为：退火温度 ，引物浓度 ，能出现最高的荧光值、最小的值，且在熔解曲线分析中不出现非特异性峰。 荧光定量反应标准曲线的建立 将标准样品倍倍比稀释，取、拷贝 种不同浓度重组质粒作为模板进行荧光定量扩增反应，得到扩增反应的
9、标准曲线（图），线性回归方程为拷贝数（）。 熔解曲线分析 在 荧光定量结束后对扩增反应进行熔解曲线分析，结果见图。扩增产物的溶解温度为.0 ，没有引物二聚体和非特异性产物等其他峰值出现。 敏感性试验 将标准样品倍倍比稀释，取、 拷贝 种不同浓度重组质粒作为模板进行荧光定量扩增。由图可知，结果显示其灵敏度为拷贝。 特异性试验 由图可知，以、 、 进行荧光定量反应，以确定建立的荧光定量诊断方法的特异性，结果为阳性，而、 、 为阴性。 重复性试验 应用建立的荧光定量方法重复检测 样品次，以检验结果的可靠性，结果均一致。 试剂盒的组装与保存期检测 应用建立的荧光定量组装成试剂盒。试剂盒组成：荧光定量反
10、应混合液（ ） ； ；引物 ；阴性对照 ；阳性对照 ，去离子水 ；裂解液 。将试剂盒保存在 、 分别于个月、个月、个月、年对阳性样品进行检测， 保存年阳性拷贝数降低99%， 保存个月、个月、个月、年对阳性拷贝数无影响。 试剂盒对临床样品的检测 对年贵州省贵阳市、黔西南、遵义、黔南州、铜仁地区几个生猪养殖场和养殖专业户份疑似病料（组织）的荧光定量阳性率为（），普通阳性率为（）。头份发病猪场未发病猪血清荧光定量阳性率为0（），普通阳性率为（）。 小结与讨论 猪细小病毒基因是其主要免疫原性蛋白，在决定毒株的组织嗜性和致病性上起重要作用。王金良等应用猪细小病毒全基因进行原核表达建立了间接检测方法。赵俊
11、龙等根据猪细小病毒基因，建立的猪细小病毒方法能检测出的病毒含量。但普通检测的灵敏度相对较低，主要用于组织病料的检测，不能有效检出猪群血清中的隐形感染。李小康等建立基于探针的猪细小病毒荧光定量检测方法，该方法的敏感性为拷贝，可有效检测出淋巴结、肺脏等组织中的，但其未对感染猪场未发病猪血清进行检测。 基于 的实时荧光定量技术则无需探针，且价格较探针低廉，但荧光染料能和任何双链结合。因此，它也能与非特异的双链（如引物二聚体）结合，容易产生假阳性信号，但可以通过融解曲线分析克服这一缺陷。本研究根据猪细小病毒基因序列设计特异性的引物，利用技术扩增获得猪细小病毒基因片段，并克隆到载体上作为阳性标准品。通过
12、对 荧光定量反应条件的优化，建立了猪细小病毒的 荧光定量诊断方法，灵敏度可达拷贝/，扩增产物的溶解温度为.0 ，没有引物二聚体和非特异性产物等其他峰值出现，适合于临床样品的检测。 本研究中份疑似病死猪病料（组织）中病毒含量量较高，因此荧光定量和普通符合率为，而发病猪场未发病猪血清病毒含量较低，普通未检测到血清中的病毒，而研制的试剂盒能检测到隐性感染的。因此，本试剂盒可应用于早期感染和隐性感染检测，有利于猪场的净化。 参考文献： 殷 震，刘景华动物病毒学第二版北京：科学出版社， 李刚明，姜天童，方雨玲，等猪细小病毒的分离与鉴定中国兽医科技，（）： 戎 伟，杨润德聚合酶链式反应检测猪细小病毒方法的
13、研究中国预防兽医学报，（）： 袁亚男，刘文忠实时荧光定量技术的类型、特点与应用中国畜牧兽医，（）： 李 安，谢金文，魏加贵，等荧光定量技术在分子检测上的研究进展中国畜牧兽医，（）： 余 波，谭诗文，冉懋韬，等检测野毒株、及多重方法的建立及初步应用畜牧与兽医，（）： ， ， ： ，： 刘艳华，范伟兴，隋兆峰，等猪细小病毒株基因的克隆及序列分析中国病毒学，（）： 赵俊龙，陈焕春，吕建强，等猪细小病毒基因的克隆、测序与原核表达畜牧兽医学报，（）： 王金良，沈志强，唐 娜，等猪细小病毒及间接株全基因原核表达检测方法的建立中国兽医杂志，（）： 赵俊龙，陈焕春，吕建强，等猪细小病毒检测方法的建立与应用中国兽医学报，（）： 李小康，崔保安，陈红英，等实时荧光定量检测猪细小病毒中国兽医学报，（）： 沈志强，王金良，郭显坡，等 实时荧光定量检测猪细小病毒方法的建立及初步应用中国兽医学报，（）： （责任编辑 程碧军）