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1、第六节 蛋白质的性质及分离分析技术,蛋白质的理化性质,一、两性性质及等电点 二、胶体性质 三、变性与复性作用 四、蛋白质的沉淀作用 五、沉降作用 六、蛋白质的颜色反应 七、蛋白质的紫外吸收性质,一、蛋白质的两性解离与等电点,蛋白质分子中氨基酸残基的侧链上存在游离的氨基和羧基，因此蛋白质与氨基酸一样具有两性解离性质，具有特定的等电点（pI）。 溶液pHpI时，蛋白质所带正负电荷相等； pHpI时，蛋白质带净负电荷； pHpI时，蛋白质带净正电荷。,等电点时特点： （1）净电荷为零 （2）一定离子强度的缓冲液：等离子点特征常数 （3）多数蛋白质在水中等电点偏酸 碱性AA/酸性AA 等电点 胃蛋白酶
2、 0.2 1.0 血红蛋白 1.7 6.7 细胞色素C 2.9 10.7 菊糖酶 0.34 8.2 （4）导电性、溶解度、黏度及渗透压都最小。 等电沉淀和蛋白电泳： 迁移率与净电荷量、分子大小、分子形状等有关,带电粒子在电场中移动的现象称为电泳（electrophoresis） 。,电泳： Whats electrophoresis?,一、蛋白质的两性解离与等电点,蛋白质分子在一定pH的溶液中可带净的负电荷或正电荷，故可在电场中发生移动。 不同蛋白质分子所带电荷量不同，且分子大小也不同，故在电场中的移动速度也不同，据此可互相分离。,一、蛋白质的两性解离与等电点,二、蛋白质的胶体性质,蛋白质分子
3、的颗粒直径已达1100nm，处于胶体颗粒的范围。（亲水胶体） 蛋白质具有胶体溶液的性质：布朗运动、丁道尔现象、不能透过半透膜、具有吸附力等。,1、蛋白质具有胶体溶液的性质,二、蛋白质的胶体性质,2、稳定蛋白质亲水溶胶的两个重要因素： 水化膜 - 通过氢键与水结合 表面电荷- 在非等电点状态下，双电层，带 同性电荷蛋白质分子互相排斥。,蛋白质颗粒的表面电荷和水化膜,3.蛋白质凝胶 凝胶作用： 蛋白质颗粒周围的水膜是不均匀,使它们以一定的部位结合形成长链。这些长链又彼此结合成为复杂的网状结构的凝胶体。,溶胶：蛋白质作为分散相，水为连续相形成的溶液。 凝胶：蛋白质为连续相，水为分散相形成的网状凝胶体
4、。,二、蛋白质的胶体性质,3.蛋白质凝胶 凝胶具有胀润作用： 分类：（1）可逆性凝胶 （2）不可逆性凝胶 部分破坏水化膜、适当加热和远离等电点 4.蛋白质胶体性质的应用 渗析（透析） 超滤,二、蛋白质的胶体性质,三、蛋白质的变性、复性与凝固作用,在某些物理或化学因素的作用下，蛋白质严格的空间结构被破坏（肽键不断裂，一级结构不变），从而引起蛋白质若干理化性质和生物学性质的改变，称为蛋白质的变性(denaturation)。,Whats denaturation of protein?,1、变性理论 蛋白质的变性就是天然蛋白质分子中肽链的高度规则的紧密排列方式因氢键及其他次级键的破坏而变成不规则的
5、松散排列方式。 2、引起蛋白质变性的因素： 物理因素： 高温、高压、紫外线、电离辐射、超声波、机械搅拌 化学因素： 强酸、强碱、有机溶剂、尿素、胍、重金属盐等。,变性的因素及作用机制, 物理性质： 旋光性改变，溶解度下降，结晶能力下降，沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等； 化学性质： 官能团反应性增加，呈色反应增强，易被蛋白酶水解。 生物学性质： 原有生物学活性丧失，抗原性改变。,变性蛋白质的性质改变,蛋白质变性的可逆性复性： 某些蛋白质变性后可以在一定的条件下重新形成原来的空间结构，并恢复原来部分理化特性和生物学活性，这个过程称为蛋白质的复性（renaturation）。,蛋白质变性的可逆
6、性与复性,蛋白质在体外变性后，绝大多数情况下不能复性； 如变性程度浅，蛋白质分子的构象未被严重破坏；或蛋 白质具有特殊的分子结构,并经特殊处理则可以复性。,核糖核酸酶的变性与复性,天然构象,蛋白质变性的可逆性与复性,可逆变性： 变性条件除去后仍可恢复天然状态的变性。 不可逆变性： 变性条件除去后不能恢复天然状态的变性。,蛋白质的热变性与凝固作用,1、热变性 热变性的定义 热变性三个阶段 影响热变性的因素: 温度、砂糖、H+浓度、蛋白质含水量、电解质；,蛋白质的热变性与凝固作用,2、蛋白质的凝固作用 天然蛋白质变性后，变性蛋白质分子互相凝集或相互穿插缠绕在一起的现象成为蛋白质的凝固（coagul
7、ation） 。,凝固作用分两个阶段： 首先是变性； 其次失去规律性的肽链聚集缠绕在一起而凝固或结絮;,蛋白质变性的应用,理论上： 研究蛋白质分子结构与功能,分子量测定,亚单位拆分； 生产生活中有利的一面： 食品加工，消毒灭菌等； 非蛋白生物物质提取纯化，终止酶促反应； 生产生活中不利的一面： 活性蛋白制品（酶、抗体）的分离提取和保存；,外加一些因素去除蛋白质胶体的稳定因素后，使蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象称为沉淀（precipitation）。,1. Whats precipitation of protein?,变性后的蛋白质由于疏水基团的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白质不一定都是
8、变性后的蛋白质。,四、蛋白质的沉淀作用,2.沉淀种类：可逆与不可逆,四、蛋白质的沉淀作用,3.沉淀方法： 沉淀后蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法 沉淀后蛋白质失去生物活性的沉淀方法,2.沉淀种类：可逆与不可逆,四、蛋白质的沉淀作用,3.沉淀方法： 沉淀后蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法,（1）盐析中性盐沉淀法 （2）有机溶剂沉淀法 （3）酸沉淀法,（1）盐析中性盐沉淀,盐溶作用 盐析作用,Whats salt precipitation of protein?,蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法,（1）盐析中性盐沉淀,定义：在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉
9、淀析出，称为盐析（salt precipitation）。 作用机制: 中和电荷的同时破坏水化膜;,Whats salt precipitation of protein?,蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法,常用的中性盐：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。 盐析时，pH在蛋白质的等电点处效果最好。 盐析沉淀蛋白质通常不会引起蛋白质的变性。 优点 盐析应用举例,（1）盐析中性盐沉淀,蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法,分段盐析： 半饱和硫酸铵溶液可沉淀分子量较大的血浆球蛋白,而饱和硫酸铵溶液可沉淀分子量较小的血浆清蛋白。因此,使用不同浓度的硫酸铵溶液就可将分子量不同的蛋白质进行初步分离。,（1）盐析中性盐
10、沉淀,凡能与水以任意比例混合的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀蛋白质。 沉淀原理： 脱水作用破坏水化膜； 使水的介电常数降低，蛋白质溶解度降低。,（2）有机溶剂沉淀法,蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法,处理条件： 低温操作； 沉淀完全后尽快分离；,（2）有机溶剂沉淀法,蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法,机制：破坏电荷，等电点沉淀。,（3）酸沉淀法,（1）重金属盐沉淀法 （2）生物碱试剂沉淀法（除蛋白作用） （3）热凝固沉淀法 （4）抗体对抗原蛋白质的沉淀,3.沉淀方法： 沉淀后蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法 沉淀后蛋白质失去生物活性的沉淀方法,四、蛋白质的沉淀作用,沉降的概念 沉
11、降速率：v=dx/dt 沉降常数与单位 应用： 沉降速度法测定分子量的原理； 梯度离心分离蛋白质（氯化铯）；,五、蛋白质的沉降作用,六、蛋白质的颜色反应,1. 双缩脲反应 2. 茚三酮反应 3. 考马斯亮蓝G250 4. 福林酚试剂反应 5. 黄色反应-芳香族氨基酸的特有反应 6. 米伦氏反应酪氨酸的特有反应 7. 乙醛酸反应色氨酸的特有反应 8. 坂口反应精氨酸特有的反应,六、蛋白质的颜色反应,1. 双缩脲反应,两分子双缩脲与碱性硫酸铜作用，生成粉红色复合物 含有两个或两个以上肽键的化合物，能发生同样反应 肽键的反应，肽键越多颜色越深，粉红，紫红，蓝紫 受蛋白质特异性影响小 蛋白质定量测定；
12、测定蛋白质水解程度,六、蛋白质的颜色反应,2. 茚三酮反应 灵敏度差。 3.考马斯亮蓝G-250 本身为棕色，与蛋白质反应呈蓝色 与蛋白的亲和力强，灵敏度高 1-1000微克/毫升,六、蛋白质的颜色反应,4. 福林酚试剂反应 酪氨酸、色氨酸的反应（还原反应） 福林试剂：磷钼酸-磷钨酸 与双缩脲法结合-Lowry法 在碱性条件下，蛋白质与硫酸铜发生反应 蛋白质-铜络合物，将福林试剂还原，产生磷钼蓝和磷钨蓝混合物 灵敏度提高100倍,六、蛋白质的颜色反应,5. 黄色反应-芳香族氨基酸的特有反应 浓硝酸与酪氨酸、色氨酸的反应 生成黄色化合物 指甲、皮肤、毛发,6. 米伦氏反应酪氨酸的特有反应 酪氨酸
13、的显色反应（酚羟基反应） 米伦试剂为硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物 蛋白溶液中，加入米伦试剂，产生白色沉淀，加热后变成红色,六、蛋白质的颜色反应,7. 乙醛酸反应色氨酸的特有反应 在蛋白质溶液中加入HCOCOOH，将浓硫酸沿管壁缓慢加入，不使相混，在液面交界处，即有紫色环形成 色氨酸的反应（吲哚环的反应） 鉴定蛋白质中是否含有色氨酸 明胶中不含色氨酸,六、蛋白质的颜色反应,8. 坂口反应精氨酸特有的反应 精氨酸的反应（胍基的反应） 精氨酸与-萘酚在碱性次氯酸钠（或次溴酸钠）溶液中发生反应，产生红色产物 鉴定蛋白质中是否含有精氨酸 定量测定精氨酸,七、蛋白质的紫外吸收性质,大部分蛋白质均
14、含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。 这三种氨基酸在280nm 附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。可以对蛋白质进行定性和定量检测。 蛋白质浓度（mg/ml） =1.45A2800.74A260,蛋白质的分离纯化,一、分离纯化的基本方法,1、盐析与等电点沉淀-根据溶解度不同分离 2、层析法 离子交换层析法-根据电荷不同分离 凝胶过滤法-根据分子量、分子形状不同分离 亲和层析-根据特异性亲和力不同分离 3、梯度离心法,2、层析,层析（chromatography）是一种利用混合物中各组分理化性质的差异，在相互接触的两相（固定相与流动相）之间的分布不同而进行分离分析的技术方法。,Whats chromatography?,主要的层析技术有离子交换层析，凝胶层析，吸附层析及亲和层析等。,离子交换层析分离蛋白质,凝胶过滤分离蛋白质,3、超速离心：,利用物质密度的不同，经超速离心后，分布于不同的液层而分离。 超速离心也可用来测定蛋白质的分子量，蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比。,二、蛋白质含量的测定,1、凯氏定氮法 2、双缩脲法 3、福林酚试剂法 4、紫外吸收法 三、蛋白质相对分子质量的测定 1、化学测定法 2、超离心沉降速度法 3、凝胶过滤法 4、SDS-PAGE,