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1、一种可同时检测PCV2、PRV、PRRSV的mPCR方法随着我国养猪业向集约化、现代化方向发展,猪 群之间相互接触的几率大大增加,给疾病传播创造了大量的机会。多病原混合感染给疾病的防控带来很大的困难,要想从根源上防控疾病传播,需要建立一种快速、准确的诊断方法用于病原体的检测。采用常规病毒分离诊断方法虽然准确,但费时费力,并且对人员的要求较高。多重PCR(multiplex pol-ymerase chain reaction,mPCR)是在常规PCR基础上发展起来的新技术,在同一个反应体系中加入2对或2对以上引物,分别扩增不同病原微生物的模板,可获得不同的目的片段,这种方法既保留了常规PCR方
2、法的特异性和敏感性,又减少了操作步骤及试剂用量,可以在同一反应中检测多种病原微生物的特异基因,同时检测鉴别出多种病原体,无论在致病微生物引起的传染病诊断方面,还是在环境中致病微生物的检验领域,mPCR技术都具有较广阔的应用前景。在临床混合感染的鉴别诊断上具有独特的优势和极高的实用价值。猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)既和猪繁殖障碍和呼吸道疾病有关,又和猪免疫抑制性疾病相关,它们都可以不同程度地损伤机体的免疫功能,降低机体对外界的抵抗能力,为继发或并发其他病原微生物创造了条件,这可能也是混合感染多发的原因。本研究拟建立一种能够同时检测PCV
3、2、PRV、PRRSV的mPCR方法,以期对临床样品进行早期、快速、准确的诊断,为猪病的防制提供科学依据。1 材料与方法1.1 病毒和细胞PCV2、PRV、PRRSV和PK-15细胞、Marc-145细胞均由沈阳出入境检验检疫局检验检疫局保存。1.2 主要试剂克隆宿主菌TP10、蛋白酶K购自天根生物工程有限公司。TRIzol试剂、Taq DNA聚 合 酶、RNase Inhibitor、dNTP、DL2000 DNAMarker、AMV反转录酶、pMD18-T载体DNA提取试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司;胶回收(小量)试剂盒购自杭州爱思进生物科技有限公司;无水乙醇等分析试剂均为国产分析纯。
4、1.3 引 物 设 计参 照GenBank登 录 的PCV2、PRV、PRRSV基因组序列,查阅相关文献,借助Oligo 6.0引物设计软件,设计3对特异引物,用于扩增PCV2、PRV、PRRSV目的基因片段,引物的序列见表1。引物由大连宝生物工程有限公司合成,用双蒸水稀释为20mmol/L,-20保存备用。1.4 临床样品收集收集来自辽宁省的30份猪呼吸道综合征肺脏样品,吉林省50份保育仔猪脾脏和淋巴结样品,黑龙江省40份断奶仔猪脾脏和淋巴结样品,山东省50份猪流产胎儿样品,福建省30份保育猪病料。所有样品均提取DNA和RNA,用于多重PCR和单一病毒PCR临床样品的检测。1.5 样品DNA
5、和总RNA的提取将临床样品利用DNA提取试剂盒(按照天根生化科技有限责任公司生产的DNA提取试剂盒说明书进行)和RNA提取试剂盒(按照杭州爱思进有限责任公司生产的DNA提取试剂盒说明书进行)进行核酸提取。将提取的DNA和总RNA于-80保存。1.6 RT-PCR反应逆转录反应在20μL体系中进行,包括提取 样品 总RNA 5μL,反转 录溶液 50mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)、75 mmol/L KCl、3mmol/L MgCl2、10 mmol/L DTT4μL、dNTP 6μL、50pmol/L PRRSV反转录引物1μL、AMV反转录酶(2
6、00U/μL)1μL和RNA酶抑制剂(40U/μL)1μL,用DEPC水补足至20μL,42水浴1h,705min。将反转录的cDNA于-20保存。1.7 PCV2、PRV、PRRSV的PCR扩 增PCV2、PRV、PRRSV的PCR反应在25μL体系中进行,包括10×PCR缓冲液2.5μL,dNTP 2μL,20pmol/L的PCV2、PRV、PRRSV特 异 性 引 物 各1μL,TaqTMDNA聚 合 酶1U,DNA或cDNA模 板 各1μL。反应程序:945min;9445s,55(PCV2、PRRSV、PRV)1
7、min,721min,最后72延伸10min。取10μL PCR扩增产物于10g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。1.8 mPCR反应条件的优化及mPCR对mPCR反应条件,包括退火温度(4558),引物浓度(520μmol/L),Mg2+浓度(1.5500mmol/L),dNTP浓度(150500μmol/L),TaqTMDNA聚合酶浓度(0.54U),反应体积(2540μL)进行优化,以确定最佳反应条件。mPCR反应在50μL反应体系中进行,包括30mmol/L MgCl22.5μL,10×PCR缓冲液(500mmol/LKCl,100mmol/
8、L Tris-HCl,pH 8.3)4μL,2.5mmol/L dNTP 4μL;10pmol/L的 特 异 引 物 各0.5μL,TaqTMDNA聚合酶1.5U,PRV、PCV2、PRRSV DNA或cDNA各1μL,用双蒸水补足至50μL。反应条件为:945min;941min,5530s,721min,35个循环;最后72延伸10min。取10μL PCR扩增产物于10g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。1.9 mPCR的敏感性试验mPCR反应及每种病毒PCR反应的敏感性参照文献的方法进行。将提取的病毒核酸用蛋白质核酸仪测定浓度后,用双蒸水做5倍系列稀释,
9、取每个稀释度的病毒模板进行mPCR反应,同时将经10倍系列稀释的病毒核酸用于单病毒的PCR反应。1.10 mPCR的特异性试验以猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(SIV)、猪圆环病毒1型(PCV1)、PCV2、PPV、PRV、PRRSV、大肠杆菌(E.coli)为模板分别进行mPCR反应。1.11阳 性 样 品 的mPCR检 测将 已 知 含 有PCV2、PRV、PRRSV的阳性病料,提取病毒核酸,分别进行PCV2、PRV、PRRSV的mPCR反应,PCV2、PRV多重PCR反应、PCV2、PRRSV多重PCR反应以及PRV、PRRSV的mPCR反应,每个反应重复进行3次。1.12 mPCR对
10、临床样品的检测对来自吉林、辽宁、黑龙江共200份临床样品进行mPCR检测,并且与各自的单PCR同时对这些样品进行重复检测,每个样品均重复检测3次。2 结果2.1 PCR产物的鉴定PCV2、PRV、PRRSV的PCR扩增片段经胶回收连接到pMD18-T载体上,经TP10转化后,送大连宝生物工程有限公司测序,结果表明,扩增片段分别为各自病毒的特异性条带如图1所示。2.2 敏感性试验在mPCR反应中,各种病毒的最低检测量分别为32.5pg(PRV)、25.2pg(PCV2)、35.9pg(PRRSV)(图2)。在单一病毒的PCR反应中,各病毒的最低检测量分别为1.0pg(PCV2)、3.2pg(PR
11、V)、2.5pg(PRRSV)(图3)。2.3 特 异 性 试 验CSFV、SIV、PCV1、BVDV、PPV、E.coli均 未 扩 增 出 条 带,而PCV2、PRV、PRRSV均扩增出各自病毒的特异性条带(图4)。2.4 阳性样品的mPCR检测各病毒的特异性引物均能很好地扩增出各自病毒的特异性目的条带(图5)。2.5 mPCR对临床样品的检测PCV2感染率为80%(160/200),PRV感 染 率 为21%(42/200),PRRSV的感染率为78%(156/200)。200份临床样品主 要 为PCV2和PRRSV混 合 感 染,阳 性 率 达56.0%(112/200);此 外,有1
12、4份 样 品 为PRV和PRRSV混合感染,阳性率为7%(14/200)(表2)3 讨论本研究建立的mPCR诊断方法能够对临床样品中PCV2、PRV、PRRSV单独或混合感染进行快速、准确的检测及鉴定,结果表明,该诊断方法敏感性好、特异性高,具有广阔的应用前景。在mPCR反应中,引物的设计至关重要,它决定着mPCR反应的成功与否。本研究设计的引物是针对3种猪病病毒各自相对保守的基因序列的,它们分别是PCV2ORF2基因、PRV gB基因、PRRSV N基因,这些基因具有高度的保守性,因此能够用作PCR扩增的目的基因。在这3种病毒中,由于PRV属于疱疹病毒科,其(G+C)含量较高,达73%,因此
13、,在设计引物时,将扩增PCV2、PRV、PRRSV这4对引物的(G+C)含量控制在45%60%,这样能确保所有的引物在相近的退火温度进行多重PCR扩增,为成功进行多重PCR反应奠定了基础。另一方面,在考虑退火温度时,将退火温度调整为55,能让病毒各自的目的条带都得到很好的扩增,结果表明,多重PCR均能够得到很好的扩增,同时避免了引物间的非特异性扩增。建立一种多重PCR诊断方 法 不 是 件 容 易 的 事 情,需 要 对 引 物 浓 度、Mg2+浓度、dNTP浓度等反应条件进行优化,以确定最 佳 反 应 条 件,从 而 建 立 起 检 测PCV2、PPV、PRV、PRRSV的多重PCR反应。在
14、对多重PCR敏感性进行分析时,为了更准确地测定多重PCR反应的敏感性,病毒核酸经5倍系列稀释进行多重PCR反应,以测定其核酸最低检测量。同时,将单一病毒PCR的敏感性与病毒多重PCR的敏感性进行对比,结果表明,多重PCR的最低核酸检测量与单一病毒的最低核酸检测量相比,均相应减少了101102个数量级,但仍然具有很强的敏感性,达到了pg级,结果表明,建立的mPCR反应具有很好的敏感性。通过对临床样品进行检测,可以看出,PCV2在猪场中存在普遍感染,这与PCV2的血清学流行病学调查结果相一致。此外,PCV2和PRRSV在保育猪中的检出率很高,并且混合感染现象相当严重,这应成为今后猪病防制的重点。近年来,随着规模化养猪的不断发展,PCV2、PRV、PRRSV对养猪业造成的危害正日益加剧。本研究建立的PCV2、PRV、PRRSV多重PCR诊断方法能够快速、准确地对这3种病毒的临床感染样品进行检测,为病原体的诊断提供了一种新的方法。