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1、核磁共振技术在蛋白质结构测定中的应用 核磁共振技术在蛋白质结构测定中的应用 化学与化工学院 化学基地班 徐周毅201000111136 摘要：在强磁场中，原子核发生自旋能级分裂，当吸收外来电磁辐射时，将发生核自旋能级的跃迁，产生核磁共振现象。核自旋能级的共振频率和原子的类型有关，且受到所处化学结构微环境的影响。由此核磁共振能够提供分子的结构信息，并被广泛应用于化学领域的研究。随着技术的不断发展，核磁共振技术开始作为解析高分辨率蛋白质结构的重要方法。 关键词：核磁共振；蛋白质结构 Nuclear magnetic resonance applications in structure deter
2、mination Abstract: nuclear magnetic resonance spectroscopy has emerged as the method of choice for studying protein structure in solution and solid. And has the unique advantage of being capable of elucidating the structure.In this review,I briefly summarize the methods for studying protein structur
3、e by using NMR,accompanied by example to demonstrate the latest developments in the field. Key words:NMR；protein structure 引言：21世纪是生命科学的世纪。负责生命活动的是生物大分子，生物大分子之间的相互作用构成了生命活动的基础，因此，认识生物大分子，深入了解生物大分子的结构功能是掌握生命活动本质的要求。高分辨蛋白质的结构测定目前主要是依赖于两种检测手段：X射线晶体衍射和核磁共振。在蛋白质数据库（PDB）收录的生物大分子结构中，用X射线晶体学、核磁共振波普学（NMR）和电子
4、显微学（EM）方法测定的结构各占有一定的比例。图1数据曲子2010年9月的PDB数据库，课件用NMR解析的结构数目逐年增加，在2007年达到顶峰。NMR技术的最大优点在于他能对溶液和非晶态中的蛋白质进行检测，实验条件更接近于生物大分子的生 理环境，适用于分析不能结晶或者结晶后的构象可能会改变的蛋白质，因此，NMR技术成为除X射线以外最主要的蛋白质结构测定方法之一。 图1三种主要方法测定的生物大分子结构数逐年增加情况 1.核磁共振技术测定生物大分子三维结构的发展历程 核磁共振现象即是具有磁矩的原子核，或称核自旋，在静磁场和射频磁场的共同作用下，可以吸收射频场能量，由低能态跃迁到高能级的现象。产生
5、这一共振吸收现象的静磁场强度与射频场频率成正比关系。后来，科学家们又发现了物质中原子核的核磁共振信号的化学位移，即共振信号的频率位置与原子核所处的微观结构环境有关，可以提供分子的结构信息。由此，核磁共振方法被广泛的应用于化学研究。然而核磁共振技术也面临着诸多的问题，由于核磁共振本身固有的性质，极慢的信号采集方式和低灵敏度阻碍了核磁共振方法的进一步发展，直到1996年，Ernst教授将傅立叶变换概念引入核磁共振方法。 在脉冲傅立叶变换核磁共振方法中，射频脉冲加到样品的原子核上，在时间域内收集共振信号，然后由傅里叶变换将时间域信号变成频率信号，获得一维核磁共振波谱。1971年，比利时的J. Jee
6、ner提出了二维核磁共振的理论和方法。基于二维核磁共振的基本原理，在二维核磁共振波谱，每一个共振峰都由两个频率定位，如果其中一个频率与其他核的共振频率重叠，另一个频率仍然可以分辨 该共振峰，而两个频率都发生重叠现象的几率更小。因此，二维核磁共振方法为13 研究生物大分子开辟了新的途径。80年代，基因工程技术进一步发展，C和15N稳定同位素标记的蛋白质可以在微生物中大量表达，促使三维、四维核磁共振方法的迅猛发展。 由于传统的NMR实验耗费时间，快速核磁共振方法越来越受到重视，近几年来发展的几种快速NMR方法突破了传统的采集技术或数据处理模式，最大限度地获得低维图谱的结构信息。2002年，Szyp
7、erski 等人提出了“降维NMR”的思想，即把n维NMR谱的信息压缩到n-1维谱中1随后出现的GFT-NMR方法2、投影重建的方法PR-NMR3和基于Hadamard 变换4的快速NMR方法，可以使实验时间成数十倍的减小，并克服了RD-NMR多重峰的落点。随机采用模式是近来受到广泛关注的新型采用模式，该技术避开了传统的矩阵型采用模式，使采样点在间接维度上随机分布采样点数远小于传统方法，再通过强大的计算机重建技术还原成经典的核磁谱图。由于它不采用热河既定的采用图形（如辐射图、螺旋形、圆形等），谱图重建由于随机噪音相互抵消，谱图中的噪音伪峰较少，由快速采用方法而发展起来的多种谱图重建的计算方法各
8、有优劣，但均促进了NMR技术的发展。 图2 同位素标记技术及相应的NMR技术的发展历程 2.蛋白质结构核磁共振研究的基本方法 2.1同位素标记蛋白样品的制备 同位素富集分为全标记和选择性标记两种方式。全标记是将细菌培养基中的氮源或者碳源化合物全部用15N，13C标记的化合物代替5,6，这样蛋白质的生物合成过程中仅摄取含有同位素标记的初始物，达到蛋白质全标记的目的，随着研究的蛋白质分子量增大，2H全标记的样品液逐渐普及，从而可以有效地提高信号强度和分辨率。选择性标记是指仅对某些特定种类的氨基酸或者化学基团7,8进行同位素标记，可以极大地减少信号的重叠程度，选择性标记需要对蛋白质的生物合成过程进行
9、调控，细菌培养的过程通常比较复杂，成本也较高。现在较为通用的是对特定种类的氨基酸标记，如Ala、Lys等，一般需要用缺陷型菌株，而且不同氨基酸的生物合成通路往往有交叉和重叠，要注意避免其他氨基酸被同时标记，造成混淆。 2.2核磁共振的化学位移 化学位移是指化合物中各个核周围的电子云密度不同，即处于结构中的不同位置，使得其共振频率有所差异，因此引起共振吸收峰的位移。蛋白质结构的测定中，首先确定能产生不同共振频率的原子核的化学位移，这一步骤成为化学位移的归属。一般情况下是先采集多种多维的NMR谱图，在此基础上对蛋白质的主链和侧链集团中的各个1H/13C/15N进行归属，再根据主链的化学位移（化学位
10、移指数）得到蛋白质的二级结构。因此蛋白质的化学位移又分为主链化学位移和侧链化学位移。 主链化学位移归属是指获得蛋白质肽链骨架上的原子的化学位移，主要的实验原理是通过单键或者双键的 J 耦合传递磁矩，将第i个主链酰胺基N和HN的化学位移与第i个或者i-1个CO或者C的化学位移关联起来，通过化学位移的对比以及某些氨基酸的特征化学位移值，可以将各个酰胺基团按照多肽链的顺序链接起来，并对应到蛋白质序列上，从而实现主链信号的归属。 侧链化学位移的归属的目的在于获得各个氨基酸残基测量-R基团上能够产生的核磁共振信号的原子的化学位移值，再用于主链信号归属的实验中。侧链化学位移的归属的实验原理同主链的化学位移
11、归属，在此就不再做详细介绍。 前面已经介绍，在结构生物学中，通过主链化学位移的归属能够得出蛋白质的二维结构。为了获取复杂的蛋白质结构，和由于键的伸缩，断裂和形成对构象性质的改变。通过结合NOEs和RDC（残余偶极耦合,Residual Dipolar Couplings）， 化学位移能够参与测定蛋白质的三维结构9,10,11。然而，在某些重要的例子中，我们可以看到化学位移作为单一决定因素，能够在独立的给出蛋白质三维结构11-15。 化学位移所反映出来的结构信息和NOEs所提供的结构信息具有非常大的差异，后者是指两个空间距离相近的原子通过空间进行磁矩的传递，因此NOEs能提供蛋白质结构非常清晰的
12、序列。然而，化学位移是指单个原子由于所处环境的影响产生的共振频率的偏移，是由许多的因素16-18决定的，因此要明确作用对象的作用并不容易。尽管其实际上是由残留物之间的相互接触影响的，比如氢键和临近的芳香基团，在蛋白质序列中都处于截然不同的位置。但是如果这些相互作用能够深入的被研究，在蛋白质序列中的每个原子的具体化学性质都能被测定，反过来说，就能直接由化学位移测定蛋白质的三维结构。 由剑桥大学的Andrea Cavalli教授提出的计算策略是CHESHIRE（protein structure determination with CHEmicalSHIftREstraints）探索一种通过快速
13、的经验性方法来大约测定蛋白质的结构16-18，但这是一种非常快速的方法。主要是基于ab initio 分子片段19-21取代和RDC22,23的分析以及少数未被定义的化学位移24的NMR数据25。实验原理的介绍见图.3。 百度搜索“就爱阅读”,专业资料、生活学习,尽在就爱阅读网,您的在线图书馆! 图3 图解插图是在CHESHIRE过程中的由分子片段取代过程实现的化学位移。图中所示的蛋白质是泛素，和与化学位移产生的信息兼容的由片段生成的主链的二面角。之后片段聚合在一个组合的方式来产生一组试验结构。随后利用信息提炼三级结构中包含的化学变化。 2.3结构约束因素的获取 为测定蛋白质的结构，应从多维的
14、NMR谱图中获取几何约束参数。常见的几何约束参数有：NOE，二面角和残余偶极耦合。再根据这些约束条件利用分子动力学计算，获得一组能量较低的三维结构。 在几何约束参数中，NOE数量较多，并可给出一个距离范围（0.2-0.6nm）,是蛋白质NMR结构解析最为重要的约束参数，如果平均每个氨基酸有10-20个NOE约束条件，主链的均方根偏差将达到0.05nm，大概相当于精度为0.2nm的晶体结构。获取NOE约束的方法是采集NOESY实验，最常用的是3D 15N-NOESY-HSQC和13C-NOESY-HSQC26,27。但此方法不适用于谱峰重叠比较严重的蛋白质，近年来，随着采用顺磁弛豫增强技术来获得
15、长程结构约束在蛋白质复合体结构研究中应用越来越受到重视28,29。基于此，新加坡国立大学的杨代文教授提出了一种基于4D NOESY30实验的新的结构测定策略，通过区分残基内的空间耦合关系等，使用少数几个NMR实验和相应的数据处理方法，就可以测定出蛋白质的三维结构。 但是，为了在每个维度上都获得高分辨率的谱图，每个4D NOESY 实验都需要至少四到天（取决于光谱的频率）由于物相的循环。如果NOESY的总时间能够被缩短，这个策略将会提供另一种非常具有选择性的测定中小蛋白质的方法。因此，杨代文教授又提出了一种改进的实验方法（time shared 4D NOESY）包含13134D C,C-edi
16、te NOESY，13C,15N-edited NOESY，和15N，15N-edited NOESY31,32。类似于之前所提出过的 time-shared 3D NOESY实验。 角度约束最常用的是主链肽键的二面角 和，在蛋白质不同的二级结构区（螺旋和折叠）中主链肽键的二面角不同，并引起化学位移与无规卷曲相比朝着不同的方向偏移。因此，可以简单地通过主链 CO,C,C等原子的化学位移来进行二面角预测常用的预测方法有化学位移指数（Chemical shift Index,CSI）33或基于数据库搜索的TALOS。二面角约束也可以通过测定三键犑 耦合常数来获得，如实验可以用于获得主链角约束，HN
17、HA实验可以用于获得角约束，等等。 测量RDC是近年来应用较多的一个实验方法34-36，RDC能够提供蛋白质分子内各个化学键的取向信息。与上述种结构约束不同，RDC能够提供长程的结构信息，例如不同结构域或二级结构区之间的相对空间取向，因此为蛋白质溶液结构的精确解析提供了一种新的重要约束来源在水溶液中，蛋白质分子的运动在通常情况下是各向同性的，因此偶极耦合作用在空间上的净效应为零。测定RDC的先决条件是通过一定的方法使得蛋白质运动变为各向异性，使得偶极相互作用不能完全抵消，从而产生出较弱的“残余偶极耦合”。某些自身具有顺磁特性的蛋白质能自发地在磁场中产生取向性的排列；而对于绝大多数蛋白来说，则需
18、要将其溶解于具有一定程度各向异性的溶剂中以使之产生微弱的空间取向特异性37。 2.4提高用NMR测定蛋白质结构的可靠性和速度 NMR测定蛋白质仍然面临着一些挑战：测定的方法受限于对称的，分子质量相对较小的蛋白质；数据采集的时间很长；数据分析需要经历一个很长的过程；很燃测定蛋白质结构最后的质量。在测量基因组学结构38的时候这些问题特别的明显。随着技术的发展，这些问题逐渐得到解决，蛋白质结构的计算变得极其的迅速，新的标记方法39显著的提高了光谱质量和自动分析的能力，与此同时，严格的标准和数据的模式更是能适用于各类的软件40。 最显著的进步体现在自动的数据分析和结构的测定，一种网状式的NOES测定减
19、少了在结构测定中NOE指数的优先分配情况，并简化了分析中的数学计算41,42。这样方法需要预先知道蛋白质结构中所有核（1H，13C，15N）的共振频率。自动的化学位移归属也逐渐成为一种可能43，通过良好的数据能够自动化的分析并测定蛋白质的结构。 其中一个吸引人的想法是完全的忽略化学位移来自NOE数据库的不成键的质子“云“，但由于模糊的NOE数据使得这个想法难以实现。这个想法的部分完成（通过忽略化学位移归属）在结构的自动测定的结果仍然是鼓舞人心的。RDCs允许获得折叠状的蛋白质，当与ab initio 形的折叠蛋白质软件和NMR的数据过滤器结合是，能快速有效的测定折叠蛋白质的结构44。 3大分子
20、蛋白质结构测定的研究方法 相对来说, 解析20KDa左右的蛋白质NMR结构比较容易实现。但是用核磁共振波谱法测定较大蛋白质（30KDa）的三维结构十分耗时。一般需要3-5个月，这是因为随着蛋白质分子量的增大。一方面，谱峰的数量随之急剧增大，需要采集更多的三维甚至更多维数的NMR实验才能完成谱峰的归属和获取足够的结构约束参数。另一方面, 蛋白质分子运动性能减慢。谱峰增宽，灵敏度下降，还受到自旋扩散和分子局域运动的影响。这些都非常难以解析。针对大分子量蛋白质信号较弱、重叠严重的问题，往往需要针对目的蛋白的具体情况应用特殊的核磁共振实验和谱图解析策略。 考虑到核自旋横向弛豫过程所引起的谱线加宽是2/
21、数量级，抑制横向弛豫（即使呈现慢横向弛豫，T2时间加长），就可以获得谱线线宽。基于理论，当磁场强度接近于1GHz是，15N和1HN（酰胺质子）耦合核自旋系统的四分之一的横向弛豫效应几乎被完全抑制。在实验中检测这一分量的核磁共振信号就可以获得宽谱图。由此Wuthrich于1997年提出了TROSY（transverse relaxation optimized spectroscopy）45脉冲程序。其后，他又将CRIPT(cross-correlated relaxation-induced polarization transfer)46技术与TROSY相结合，于1999年提出了CRINEP
22、T（cross-correlated relaxation enhance polarization transfer）实验脉冲程序。CRINEPT方法极大的提高了分子量大于100KD的蛋白质结构实验测定的灵敏度，极大的扩充了核磁共振所能研究的蛋白质的分子量范围。运用CRINEPT方法，已经可以研究分子量在900KD的分子伴侣GroEL-GroES复合物。 实验操作中，应用氘代、特殊标记和TROSY技术通常就能够达到结构解析的目的以大肠杆菌外膜蛋白Ompx的为例：该跨膜蛋白一共含有148个氨基酸残基，当它与表面活性剂DHPC结合后，则形成分子量大约为60k的胶束47。Wuthrich研究组制备
23、了完全2H,13C,15N标记的蛋白质样品，在30条件下采集了TROSY类型的3D NMR实验（包括HNCA,HNCACB,HNCO,HN(CO)CA等）以及TROSY类型的3D15N NOESY HSQC谱图，并得到了主链化学位移的完全归属在此基础上，利用TROSY类型的15N NOESY HSQC谱图获得主链酰胺基团之间的中长程NOE约束，就可以计算出该蛋白质的整体折叠状态48。该研究组进一步制备了在整体2H,13C,15N标记背景下选择性氢代Val1,2，Leu1.2甲基基团的ompx蛋白样品。他们将TROSY脉冲技术整合到传统的（H）CC(CO)NH TOCSY和H(CC)CONH T
24、OCSY实验中，完成了对这几个 特殊标记的甲基基团的化学位移归属；并应用部分13C标记的方法得到了Val和Leu两个末端甲基的立体异构归属。最后，从3D 15N NOESY HSQC和13C NOESY HSQC谱图中得到了足够的酰胺，甲基以及甲基酰胺之间的NOE距离约束，并辅以二面角等其他约束，成功地得到了高分辨率的三维结构49。 4.固态核磁技术简介 在核磁共振的这些相互作用中，有一些是各向同性的相互作用，另一些则是各向异性的相互作用。它们的区别在，前者对核磁共振信号频率的影响与分子的空间取向无关，而后者则有关，故后者可能因为被测分子空间取向的不同而造成谱线的宽化，导致分辨率和灵敏度的降低
25、。在液体中，由于分子的快速翻滚运动，消除了各种可能使谱线宽化的各向异性的核磁共振相互作用。因此，液体核磁共振谱图中的共振信号十分尖锐，有很高的分辨率，这是液体核磁共振成为测定溶液中化合物结构的最强大的方法的原因之一。但在固体中，由于上述分子运动的缺失导致核磁共振信号受到各向异性的相互作用影响而被展宽，分辨率和灵敏度低。如果希望得到类似液体核磁共振所给出的信息，必须通过高分辨率固体核磁共振技术才能实现50。 参考文献 1 S zyper ski T, Yeh D C, S ukumaran D K et al .Proc. Nat l.Acad. Sci. U S A, 2002, 99: 80
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