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1、,第二组,实验,设计型实验 酵母菌的分离及培养条件的优化,一、目的要求 1、掌握培养基的配置及灭菌方法，能够正确的配制 培养基并在高压灭菌锅内进行灭菌。 2、熟知培养基成分的选择原则，能够对培养基的成分和配比进行优化设计。 3、掌握固体斜面、平板的制备技术，能够通过划线、涂布等方法分离菌种。 4、熟知影响酵母菌生长繁殖各种培养条件，能够对摇瓶培养条件进行优化设计。 5、了解酵母菌培养过程的代谢变化规律。掌握酵母菌培养过程参数的测定和分析方法。,二、基本原理 酵母菌是单细胞真菌生物，具有很高的营养价值，特别是含有较多蛋白质、B族维生素、核酸和矿物质，同时也能产生一些保健功能活性物。因酵母属于简单
2、的单细胞真核生物，易于培养，且生长迅速，被广泛用于现代生物学研究中。是遗传工程研究过程中常用的受体菌种。从自然界或商品中分离纯的酵母菌株，通常采用平板或斜面涂布划线法。这两种方法简单有效，是实验室分离纯化菌种常用到的方法。 在发酵过程中定时地取样测定，包括对菌体进行镜检、测定不同时期发酵液的菌体浓度、残留的还原糖等参数，动态地了解发酵过程中过程变量的变化，分析菌体生长、基质消耗、产物生成的速度，研究发酵动力学，为生产中优化培养条件提供数据依据。,三、实验材料 （一）菌种：从安琪酵母中分离的酵母菌 （二）培养基 基础培养基YPD： 酵母浸粉1% 蛋白胨2% 葡萄糖 2% 固体培养 基再加琼脂2%
3、 优化N源培养基： 酵母浸粉1% (NH4)2SO4 2% 葡萄糖 2% ； 酵母浸粉1% (NH4)2SO4 4% 葡萄糖 2% ； 酵母浸粉1% NH4NO3 2% 葡萄糖 2% ； 酵母浸粉1% NH4NO3 4% 葡萄糖 2% ； 酵母浸粉1% NaNO3 2% 葡萄糖 2% ； 酵母浸粉1% NaNO3 4% 葡萄糖 2% ；,（三）仪器设备 超净工作台，756型分光光度计，旋转式摇床，恒温培养箱，全自动灭菌锅，三角瓶、涂布器、移液管、平皿等玻璃仪器。 （四）试剂 酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖、琼脂 (NH4)2SO4 2%、 (NH4)2SO4 4%、 NH4NO3 2% NH4NO3
4、 4%、 NaNO3 2%、 NaNO3 4%等；裴林试剂甲液、裴林试剂乙液； NaOH溶液、HCl等。,四 实验内容 1、分离单菌落 （1）实验物品灭菌 仪器：包扎9个移液管、9个涂布器、9个装有9ml蒸馏水的试管、16个平板、 液体：3g酵母浸粉1%、6g蛋白胨2%、6g葡萄糖2%，配成300ml溶液，取240ml溶液平均分装两个三角瓶中，然后每个三角瓶放入2.4g琼脂，剩下60ml为液体培养基，然后将以上设备拿去灭菌,（2）划线涂布 超净台上： 1、把240ml的培养基分别倒入15个平板，每个平板为1213ml，平板分别标10-210-10，还有倒一个斜面 2、取1ml的菌原液进行稀释梯
5、度为10-310-10 3、划线涂布 划线为原液从10-210-7；涂布从10-310-10用对应的稀释梯度液，10-2用原液涂布,2、种子培养,挑取单菌落接至种子瓶，进行种子培养 培养条件：将250ml三角瓶装培养基60ml放入摇床，将转速为180r/min,温度为30度 培养时间:12月4号早上10:37到12月5号早上8:47十个小时左右,氮源的优化方案,1.常见的有机氮源:(NH4)2SO4.NH4NO3.NaNO3 2.准备7个三角瓶分别装入以下培养基然后定容至50ml 1.酵母浸液0.5g (NH4)2SO4 1g 葡萄糖1g 2. 酵母浸液0.5g (NH4)2SO4 2g 葡萄
6、糖1g (2) 1.酵母浸液0.5g NH4NO3 1g 葡萄糖1g 2. 酵母浸液0.5g NH4NO3 2g 葡萄糖1g,(3) 1.酵母浸液0.5g NaNO3 1g 葡萄糖1g 2. 酵母浸液0.5g NaNO3 2g 葡萄糖1g 3.对比试验:酵母浸液0.5g 蛋白胨1g 葡萄糖1g 4.配置完毕调PH值 PH等于5为准确 包三个移液管然后将以上培养基一起拿去灭菌,接种培养,将种子液按9%的接种量接种到以下发酵瓶中 （NH4）2SO42%+5ml种子液 （NH4）2SO44%+5ml种子液 NH4NO32%+5ml种子液 NH4NO34%+5ml种子液 NaNO32%+5ml种子液
7、NaNO34%+5ml种子液 蛋白胨+5ml种子液,培养 时间 9：20 条件180r/min 30的摇床,测种子液的OD值,将种子液稀释10倍，以YPD培养液为标准液测其OD值 测得OD值17.2%T,取样,两小时后（11：20） PH值均为6 OD值: 稀释10倍 原液 (NH4)2SO4 2% 0.117A 1.018A (NH4)2SO4 4% 0.105A 0.863A NH4NO3 2% 0.097A 0.889A NH4NO3 4% 0.061A 0.830A NaNO3 2% 0.130A 0.845A NaNO3 4% 0.143A 0.836A 对照 0.178A 1.18
8、0A,测发酵瓶的PH值OD值及残糖量,一小时后（12：30） PH值均为5 OD值 稀释 原液 （NH4）2SO4 2% 0.210A 1.066A （NH4）2SO4 4% 0.167A 0.939A NH4NO3 2% 0.192A 1.036A NH4NO3 4% 0.106A 0.833A NaNO3 2% 0.167A 1.092A NaNO3 4% 0.161A 1.102A 对比 0.262A 1.328A,残糖量 空白 费林试剂A5ml+费林试剂B5ml+10ml水+6ml标准葡萄糖 样品 费林试剂A5ml+费林试剂B5ml+10ml水+0.5ml样品 测定结果 消耗标准葡萄糖
9、 残糖量 （NH4）2SO42% 7.08ml 1.744% （NH4）2SO44% 6.5ml 1.86% 对比 6.98ml 1.764%,结论,1、 经观察菌种生长发现稀释梯度为10-8、 10-9 的菌种进行涂布生长较好 2、 有机氮源比无机氮源效果好 (NH4)2SO4比NH4NO3、 NaNO3效果好 （NH4）2SO4 2%比（NH4）2SO4 4%效果好,实训,一、实训要求1、YPT培养基：酵母菌1%，蛋白胨2%,葡萄糖2%；2、灭菌装料量60%；3、设定参数：PH=5，T=30，转速180r/min;4、接种与培养（接种量10%）注：（1）发酵罐是否正常运行、各参数；（2）随
10、时间的延长适当调进气量、搅拌速度；（3）取样30min/次、镜检2h/次，样品进行两个平板培养。,二、配制 1、配多少培养基 10L罐装料量60%：10X60%=6L 接种量10%：培养基5400ml(实际操作培养基5000ml)，种子液600ml 2、配方用多少 6L:60g酵母浸粉1%,120gc120g葡萄糖2%； 150ml:1.5g酵母浸粉1%,3g酵母浸粉1%,3g葡萄糖2%.其中100ml加1g琼脂配成固体培养基用于倒平板；50g原液用于测OD时做标准液。 3、所需器材包扎灭菌 4个装有9ml蒸馏水的试管，6个空试管，4个涂布器，4个移液管1ml，6个平板,1、NB型空气过滤器消
11、毒,1.1在发酵罐空消前，必须对设备的NB型过滤器先进行消毒； 1.2为防止蒸汽冷凝水进入NB型过滤器，消毒前必须先打开过滤器底部的排污阀，排尽冷凝水，时间控制不少于5min； 1.3NB型过滤器的消毒温度控制在120-123之间，压力维持在0.11Mpa-0.12Mpa之间，时间确保在25min-30min之间； 1.4消毒后，在关闭蒸汽阀的同时迅速打开过滤器的进气阀换气，并用压缩空气将过滤器吹干，吹干时间一般控制在25min-30min之间； 1.5吹干后，必须对整个空气进气系统进行保压，压力维持在0.12Mpa-0.15Mpa之间。 操作注意：空气流量计内不能通入蒸汽，NB过滤器消毒前必
12、须将空气流量计出口阀关闭，以免造成设备损坏。,2、设备空消,2.1空消前，将控制系统退出自动运行状态，小心取出 PH电极和DO电极，进行清洗、校检、备用，并装好电极堵头。 2.2打开夹套排污阀，同时打开夹套蒸汽阀进汽，在同时向罐内排光冷凝水之后，关闭夹套蒸汽阀，直至空消结束。 2.3缓慢打开进气阀及底阀处的蒸汽阀进汽，待压力升至0.01Mpa后，打开罐面排气阀进行排气。 2.4调节罐面排气阀，保持罐压0.01Mpa,维持温度在120125之间，计时空消30min,2.5空消完毕，关闭进气阀及底阀处的蒸汽阀，打开底阀开始排污。 2.6开大罐面排气阀，卸去罐压后，打开罐盖上的进料口加入培养基。 3
13、 、加培养基 3.1 投料前，应校正并安装PH电极和OD电极。 3.2 按工艺要求配置好培养基原液，加入发酵罐内。 3.3 加水定容至60%-65%左右后，启动电机搅拌5min,3.4 按工艺要求调整好PH后，拧紧进料口螺盖。 操作注意；实消时蒸汽冷凝水约占培养基体积10%左右，固定容是必须扣除此容积。 4 、培养基实消 4.1 投料结束后，启动电机。慢速搅拌。 4.2 微开夹套排污阀，打开夹套蒸汽阀，保持夹套压力为0.11mpa左右，待培养基预热达到95 以上时停搅拌，关闭夹套蒸汽阀，开大夹套排污阀。 4.3 培养基温度达到95 后，缓慢打开进气阀及底阀处的蒸汽阀，同时向罐内进气，待罐压升至
14、0.11mpa后，打开罐面排气阀进行排气。,4.4 调节罐面排气阀，保持罐压0.11mpa，维持温度121 -123 之间，计时实消20min。 4.5 实消完毕，关闭底阀后关闭底阀处的蒸汽阀。 4.6 在关闭进气阀处的蒸汽阀的同时打开NB型过滤器的出气阀，进行换气，保持罐压0.05mpa-0.08mpa之间。 4.7 关闭夹套排污阀后，迅速打开夹套手动进水阀和夹套排污阀进行降温，当培养基温度降到90 左右时，开搅拌低速控制。,4.8 当培养基温度达到发酵需要的温度后，关闭夹套手动进水阀，调整转速至正常转速，将控制系统切换至自动；运行状态，调整进风量、罐压，等待接种。 操作注意；因为调压过滤器
15、出口空气压力在0.12mpa-0.15mpa之间，所以必须在发酵罐压力降至0.1mpa以下时方可进行唤起操作，且必须先换气后降温，防止设备失压。 5、接种 5.1准备好合格的摇床菌种，接种量根据工艺要求确定。,5.2用75%酒精棉球擦洗进料口四周后，搁上接种火圈，并在接种火圈内围上酒精棉球，接种者双手也需用酒精棉球擦洗消毒。 5.3减少进气量，控制罐压在0.02MPa左右后，点燃接种火圈内的酒精棉球。 5.4 拧下进料口螺盖，放入盛有酒精的培养皿中。 5.5将接种瓶是瓶口在火焰上烧一下，并在火焰的保护下拔下瓶塞，迅速将菌种倒入发酵罐内。 5.6旋上进料口螺盖后灭火焰，拧紧螺盖，并用酒精棉球将进
16、料口擦洗干净。,5.7重新调整进风量，保持罐压在0.05MPa。 注意事项：操作中动作要迅速，罐压不得跌零，否则会导致染菌。 6、取样 6.1打开取样放料阀处的蒸汽阀，微开取样放料阀，保持10min后关闭两阀门。 6.2打开底阀和取样放料阀，放出少量培养液后关闭取样放料阀。 6.3用酒精火焰封取取样放料口，把无菌取样瓶口置于酒精火焰上拔去瓶盖，打开取样放料阀取好样后，立即盖上瓶盖同时关闭底阀。,6.4再次打开取样处放料阀处的蒸汽阀，对取样放料阀口再灭菌，保持时间10min后关闭两阀。 注意事项：若不需要取无菌样时，可不进行酒精火焰保护的操作。整个培养过程的总取样量一般不超过发酵液体积的10%，否则诸如氧传递速度等会受到影响。 7、出料 7.1调小罐面排气阀，调节进气阀，将罐压升至0.05MPa0.1MPa之间。7.2打开底阀和放料阀，使发酵液通过放料管放到盛料容器或下一道工序。 7.3如发酵失败，必须将发酵液灭活后方可排除。,谢谢,