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1、金黄色葡萄球菌检验与计数,概况,金黄色葡萄球菌 (Staphyloccocus aureus Rosenbach) 是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属（Staphylococcus），可引起多种严重感染。有“嗜肉菌的别称。,金黄色葡萄球菌的生物学特性,典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8m左右，显微镜下排列成葡萄串状。金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。,培养特性： 易培养，对营养要求不高，在普通培养基中生长良好。 需氧或兼性厌氧。 最适生长温度37C，最适生长pH 7.4。耐盐性强，在含1015%的氯化钠培养基中仍能生长，可用于筛选菌种。 在普通营养琼脂平板上培
2、养1824，可形成圆形、表面光滑、不透明的菌落。可产生金黄色色素，色素为脂溶性，不溶于水，故色素只局限于菌落内，不渗至培养中。,在血平板上可形成明显透明的溶血环。为型溶血。 可产生卵磷脂，在卵黄高盐培养基上形成周围有白色沉淀环的菌落。 大多数菌株分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红试验、 VP试验多为阳性，不产生靛基质。触酶阳性。,金黄色葡萄球菌的检测程序,检样25g(mL) 225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液,7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤,361,Baird-Parker平板，血平板,涂片染色,观察溶血,血浆凝固酶试验,报告,血平板1824h， Baird-Parke
3、r平板1824h或4548h。,BHI肉汤和营养琼脂小斜面,361,1824h,Baird-Parker琼脂平板,金黄色葡萄球菌的菌落形态：圆形、光滑凸起、湿润，直径约23mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度，偶而可见无混浊带和透明圈的非典型菌落。,金黄色葡萄球菌的菌落形态：呈金黄色，有时也呈白色，大而突起，圆形、不透明、表面光滑，周围有透明的溶血环。,金黄色葡萄球菌的重要鉴定-血浆凝固酶试验,试验原理：致病性的金黄色葡萄球菌产生的血浆凝固酶，使血浆中纤维蛋白原转变为纤蛋白，附着于细菌表面 ，产生凝固。 金黄色葡萄球菌可产生
4、两种凝固酶：一种是与细胞壁结合的凝固酶，为结合凝固酶；另一种是菌细胞释放于培养基中，为游离凝固酶。二者的抗原性不同。,血浆凝固酶试验,挑取BairdParker平板或血平板上可疑菌落1个或以上，分别接种到5mL BHI和营养琼脂小斜面，361培养18 h24 h。 取新鲜配置兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入可疑菌落的BHI培养物0.2mL0.3mL，振荡摇匀，置361温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，判定为阳性结果。,同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。 结果如可疑，挑取营养琼脂
5、小斜面的菌落到5mL BHI，361培养18h48h，重复实验。,结果报告,如血浆凝固酶试验阳性，可判定为金黄色葡萄球菌 。 报告在25g（mL）样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。,第一法:平板计数法,检验程序,检样25g(mL) 225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液,10倍稀释,选择三个连续的适宜浓度的样品匀液，接种Baird-Parker平板,计数及血浆酶试验,报告,361,4548h,典型菌落计数与计算公式的应用,计数范围要求：选择合计菌落数在20200的平板，计数典型菌落。,公式一,T=AB/Cd T:样品中金黄色葡萄球菌落数； A:某一稀释度典型菌落的总数 ； B:某一稀释度血浆凝固酶阳
6、性的菌落数 ； C:某一稀释度用于血浆凝固酶试验的菌落数； d:某一稀释度。,公式二的使用范围：平板菌落数均在20 cfu200 cfu之间。 N=T/1.1d T：两个稀释度平板上确认的金黄色葡萄球菌菌落总数之和； d：稀释因子(第一稀释度)。 公式引用于ISO 6888-1:1999(E),公式二,结果报告,单位：cfu/g或者cfu/mL；若T或者N为0，报告1d-1 cfu/mL(g)。,第二法 MPN法,MPN检验程序,25g(mL)检样+225mL稀释液， 匀质,10倍系列稀释,选择3个适宜稀释度的样品匀液，吸1mL样液，每稀释度各接种3管胰酪胨大豆肉汤，样品的最高稀释度，能达到获
7、得阴性终点,361,4548h,接种Baird-Parker平板,血浆凝固酶试验,4548h,361,查MPN表,报告结果,结果报告,计算血浆凝固酶试验阳性菌落对应的管数，查MPN检索表。 结果报告： MPN/g或MPN /mL,第三法PetrifilmTM测试片法,适用范围,PetrifilmTM测试片法适用于肉及其制品，奶制品等。,PetrifilmTM测试片法检验程序,检样25g(mL)+225mL稀释，匀质，10倍系列稀释,选择适宜稀释度的样品匀液，各取1mL分别加入纸片,361,242h,判读,没有菌落,只有典型紫红色菌落,将所有紫红色菌落计数为金黄色葡萄球菌,除典型紫红色菌落外其他颜色的菌落,加入确认反应片， 361，培养13h,有粉红色菌晕的菌落计数为金黄色葡萄球菌,报告,金黄色葡萄球菌PetrifilmTM测试片，含具有显色功能、经改良的Baird-Parker培养基，对金黄色葡萄球菌的生长有很强的选择。金黄色葡萄球菌在测试片上生成为暗紫红色的菌落，可以直接完成鉴定和计数。,谢谢!,