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1、革兰氏染色与荚膜染色,（一）革兰氏染色法原理,革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram创立的。作为细菌学上最常用最重要的鉴别染色法，革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G）两大类。 G菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。 G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。,（二）荚膜染色法原理,荚膜是包围在细
2、菌细胞外的一层粘液状或胶质状物质。 由于荚膜与染料的亲和力弱，不容易着色；而且可溶于水，易在用水冲洗时被除去。 所以通常用衬托染色法(负染色法)染色，使菌体和背景着色，而荚膜不着色，从而在菌体周围形成一透明圈。 由于荚膜富含水分，制片时应自然干燥，不可以加热固定，避免加热蒸发，影响观察。,三、实验器材,1、菌种：枯草杆菌（Bacillus subtilis）， 大肠杆菌（Escherichia coli）， 未知菌（环境中分离）（斜面培养物） 褐球固氮菌（Azotobacter chroococcus）装片。 2、染色液和试剂：草酸铵结晶紫、卢戈氏碘液、95%乙醇、番红、二甲苯、香柏油 3、器
3、材：显微镜、洗瓶、载玻片、接种环、酒精灯、擦镜纸、废液缸,四、革兰氏染色法实验步骤,流程路线： 涂片 干燥 固定 草酸铵结晶紫染色1min水洗干燥 碘液媒染 1min 水洗干燥 95%乙醇脱色 1520秒 水洗干燥 番红复染1min 水洗干燥 镜检,(1)涂片 干燥 固定:,2,1,（2）草酸铵结晶紫染色1min 水洗干燥,（3）碘液媒染1min 水洗 干燥,（4）95%乙醇脱色1520秒 水洗 干燥,（5）番红复染1min 水洗 干燥 镜检,五、注意事项：,（1）在涂片时不可过厚，否则在染色脱色时，都不易均匀，固定时，不可过热，以载玻片不烫手为宜。 （2）严格掌握脱色程度，是革兰氏染色的关键
4、步骤。如脱色时间太长，阳性菌会误为革兰氏阴性菌，时间不足，革兰氏阴性菌会误为革兰氏阳性菌。 （3）在镜检时，以分散开的菌体的革兰氏染色反应为准。,（4）染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。 （5）选用幼龄的细菌。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。,荚膜示意图：,荚膜染色步骤：,1、总路线：涂片 用1%结晶紫染色3分钟 用20%CuSO4冲洗 镜检 2、涂片：,3、结晶紫染色：,4、CuSO4冲洗：,注意事项：,（1）不能加热固定，否则荚膜受热失水收缩，失去原形。 （2）涂片不要用力过猛，不要滴加水，以防破坏其荚膜原
5、形. (3)要用CuSO4冲洗，不要用水。,第4组值日,荚膜示意图：,革兰氏染色步骤涂片 干燥 固定 草酸铵结晶紫染色1min水洗干燥 碘液媒染 1min 水洗干燥 95%乙醇脱色 1520秒 水洗干燥 番红复染1min 水洗干燥 镜检,荚膜染色步骤：涂片 用1%结晶紫染色3分钟 用20%CuSO4冲洗 镜检,1、细胞壁,实验报告,给出枯草杆菌，大肠杆菌，未知菌形态图，并注明其革兰氏染色反应。 绘图示褐球固氮菌的形态特征,思考题,1.哪些环节会影响革兰色染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？ 2.进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题? 3.革兰氏染色时，初染前能加碘液吗?乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色? 4.不经过复染这一步，能否区别革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌？,