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1、猪传染性胸膜肺炎的小鼠动物模型构建(2)2.2 最佳感染途径的筛选结果根据不同接种方式感染小鼠的实验结果，发现通过皮下和肌肉注射方式感染的两组小鼠都没有出现死亡，而通过滴鼻和腹腔注射的方式感染的两组小鼠随着菌液剂量的变化，死亡情况也表现出了不同的差异，详见表 1 和表 2;但利用滴鼻感染后的小鼠虽然表现了发病及死亡情况，但变化的规律波动较大，随剂量的变化，没有表现出理想的规律性变化；从而根据各组实验动物感染后的发病和死亡情况，筛选出了感染效果较好，易于临床大量操作的感染途径是腹腔注射。2.3 App-7 对 KM 鼠的半数致死量根据不同剂量感染小鼠后的实验结果 （详见表 3），测得小鼠对 Ap
2、p-7 型菌株的 Dn 为 1.93×107CFU,Dm 为 1.15×108CFU,并通过改进的寇氏计算法则对数据进行计算，得出 App-7 对小鼠的半数致死量为 6.7×107CFU.2.4 模型动物的临床症状和病理变化通过 2 倍半数致死量的菌液对 10 只 KM 小鼠进行感染实验，发现感染后 2 h,有部分小鼠出现精神萎靡、怕冷、聚集等现象；感染后 4 h,小鼠出现活动减少，轻度的呼吸困难；感染后 8 h,大部分小鼠表现严重的呼吸困难，张口呼吸，被毛逆立，极度的精神沉郁；感染后 12 h,出现了 2 只死亡小鼠，感染后24 h 6 只小鼠死亡；另 2
3、 只小鼠表现严重的呼吸困难，活动减弱；感染后 72 h,剩余 2 只小鼠死亡，解剖24 h 内急性死亡的小鼠，发现主要要眼观病变为心包内有大量淡黄色液体，肝脏肿大并有轻度瘀血现象，脾脏稍肿大，质地较柔软，肺脏出血明显并有大量瘀点，且血液呈暗红色，胸腔有大量的泡沫样渗出物，剖检 3 d 后死亡的 2 只小鼠，肺组织表面有纤维素性渗出物，并伴有胸膜粘连；同时剖检对照组小鼠，各组织器官均未见病理性改变。2.5 模型动物组织中细菌分离与鉴定结果对死亡小鼠进行剖检，无菌采集死亡小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏等各个组织的病料，涂片，镜检，发现有多种无芽孢的球状杆菌或长杆菌，革兰氏染色阴性，与攻毒株一致
4、；同时将采集的病料分别接种于 TSA 培养基，肺脏和心脏组织经培养后可见大量表面光滑、圆形、稍突起、边缘整齐、针尖大小的菌落；其他脏器菌落数量相对较少，挑取各组织分离到的单个菌落进行 PCR 反应，均可扩增得到大小为 377 bp 的特异性条带（见图 1），与阳性对照所得片段大小一致，同时结合细菌生化鉴定和血清学试验对分离到的细菌进行鉴定，从而证明上述各器官中均有 APP-7 菌株的存在。3 讨论鉴于近年来不同血清型猪传染性胸膜肺炎的流行情况日益严峻，对养猪业造成了严重危害，给疾病的预防和控制带来了很大的困难，因此研究通过建立本病的动物模型，探索其发病机制，目前高娃等人已成功研制牛源致病性大肠
5、杆菌感染小鼠的动物模型12,并通过免疫组化的方式探索其感染小鼠后的病理表现，为实验提供了一定理论基础。实验选取临床多发的 App-7 型放线杆菌，感染临床实验常用的实验动物，通过人工感染的途径，造成实验动物发病13,从而基于发病实验动物的临床变化和死亡规律，发现死亡小鼠的病理变化与猪临床感染本病后的病理变化具有高度相似性，其他动物临床症状和死亡规律相对不明显；且死亡后在各组织中很难再分离到App-7 菌株；同时本着实验动物的经济性和便于今后大规模推广进行了多次论证，有报道指出小鼠是实验室最常用的动物，具有价格便宜，饲养管理方便，易于控制，遗传性状清楚，稳定性强等优点14,并结合实验得出的数据，
6、因此选定小鼠作为建立猪胸膜肺炎放线杆菌感染模型的首选动物，为今后下一步实验提供了基础。初步选定小鼠作为模型动物后，做了大量的实验进行探索感染的最佳途径，观察通过各种不同接种方式感染小鼠后的临床发病表现，死亡数量变化，以及操作过程的精确性和简便性，最终得出腹腔注射和鼻内滴注的感染方式，小鼠表现的临床症状最为明显，然而通过滴鼻方式感染的各组小鼠，通过由低到高不同剂量的菌液也可感染小鼠，但表现的死亡情况差异较大，规律性差，这可能与滴鼻这种方式在实际操作过程中，剂量的把控难度较大，以及小鼠的条件反射使药物的吸收量不稳定等有较大关系，经灌胃方式感染动物过程中，细菌容易受到动物体内酸性物质的破坏，从而降低
7、其致病性15;而腹腔注射组小鼠随着病原菌浓度的增减，表现出很有规律性的死亡数量变化；由于不同的接种方式对模型动物的感染情况影响较大，因此选择合适的接种途径是建立动物模型的关键步骤16,且通过腹腔注射感染小鼠后的临床症状与滴鼻感染后小鼠的表现一致，所以认为腹腔注射的方式更适合进行实验，根据之前实验的结果，计算出 App-7 型菌株对小鼠的半数致死量为 6.07×107CFU,确切评价了 App-7 型菌株感染小鼠毒力的强弱，为下一步实验提供了可靠的试验数据。4 结论通过观察小鼠感染后的症状，以及死亡小鼠的剖检结果，发现与临床上猪感染 App-7 型后具有相似发病表现和病理变化，表现出
8、了呼吸苦难、精神沉郁、体温升高和急性纤维素肺炎等症状，死亡小鼠肺脏有出血性和纤维素性渗出。根据测得的半数致死量和最佳感染方式，以及对死亡小鼠的各组织进行App 再分离和 PCR 鉴定，得到了特异性的扩增产物；从而系统性的评估了猪胸膜肺炎放线杆菌对小鼠的致病性。确定了小鼠可作为 App-7 理想的实验模型动物，为下一步研究胸膜肺炎放线杆菌在模型动物体内的动态分布，探索疾病的致病机理等奠定了科学的理论基础。参考文献：1 郝成武，马勋。检测猪胸膜肺炎放线杆菌 Apx抗体乳胶凝集试验方法的建立J.中国兽医学报，2012（3）：383-386.2 靳明武，张洋龙，孙晓雨，等。猪蓝耳病和传染性胸膜肺炎混合感染的病例报告J. 黑龙江八一农垦大学学报，2012,24（5）：32-35.3 侯红岩，何家惠，侯继波。猪传染性胸膜肺炎的流行病学和流行特点J.兽医导刊，2010（9）：33-35.