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1、 实验一 酶催化蔗糖转化反应（28学时）一、 目的和要求1 用旋光仪对酶催化蔗糖转化反应进行测定。2 了解掌握蔗糖酶的制备和酶活力的测定。3 学会米氏常数的测定。二、 实验原理蔗糖转化反应蔗糖 水 葡萄糖 果糖这个反应在H+或蔗糖酶的催化下可以很快的进行。蔗糖及其转化产物都有不对称的碳原子，它们都有旋光性，但是它们的旋光能力不同，所以可以利用体系在反应过程中旋光度的变化来描述反应进程。溶液的旋光度与溶液中所含旋光物质的旋光能力、溶剂的性质、溶液的浓度、测量样品管的长度等均有关系。当其他条件不变时，旋光度a与反应物浓度C成线形关系，即akC作为反应物的蔗糖是右旋性物质，其比旋光度为66.6；生成
2、物的葡萄糖也是右旋性的物质，其比旋光度为52.5，但是果糖是左旋性物质，其比旋光度为91.9。由于生成物中果糖左旋性比葡萄糖右旋性大，所以生成物呈现左旋性质。因此，随着反应的进行，体系的右旋角不断减小，反应到某一时刻，体系的旋光度可恰好等于零，而后就变成左旋，直到蔗糖完全转化，这时体系的左旋角达到最大值。三、 仪器和试剂旋光仪1台恒温槽1套葡萄糖、果糖、蔗糖（均为分析纯）醋酸醋酸钠缓冲溶液四、 实验步骤1 蔗糖酶的提取取鲜酵母20 g于100 mL三角瓶中，加入1.6 g NaAc，搅拌1520分钟后使团块液化，再加3 mL甲苯，混和后摇动10分钟，放在恒温箱中37保温60小时左右。取出后加入
3、3.2 mL 4 M醋酸和100 mL水使pH值在4.5左右。将混合物以每分钟3000转的速度离心30分钟，离心后形成三层，取中层黄色液体，再以同样速度离心30分钟，所得澄清的黄色液体即为蔗糖酶粗品。将此蔗糖酶用pH4.6的缓冲溶液稀释10倍，过滤后冷冻保存。2 作蔗糖转化体系旋光度和浓度的工作曲线 根据蔗糖转化体系的蔗糖和果糖、葡萄糖的比例关系，可以制作不同浓度下混和体系的旋光度的工作曲线。例如0.1 M蔗糖转化体系的旋光度和葡萄糖浓度的工作曲线，实际上是制作0.1 M蔗糖转化进程工作曲线，不同的蔗糖浓度有不同的进程工作曲线，从若干不同蔗糖浓度的进程工作曲线得到这些工作曲线直线关系很好，且直
4、线的斜率与蔗糖的浓度无关，经过线性拟合，其直线方程为：y60.28xa其中x蔗糖转化成葡萄糖的浓度（M）y蔗糖转化进程中体系的旋光度值a不同浓度蔗糖溶液的旋光度值，其值可以测定，也可以通过下式计算。a66.6LC（L10cm，C是蔗糖浓度g/mL）通过上述的直线方程，可以测定任何浓度蔗糖转化体系的旋光度值，求出其转化成葡萄糖的浓度x，从而可以求得不同反应时间的葡萄糖浓度。3 酶比活性的测定配制2.5的蔗糖溶液100 mL，测定其旋光度。在20的条件下加入蔗糖酶5 mL，反应3分钟测定体系旋光度值y，用公式 y60.28xa 求出葡萄糖浓度x，及生成葡萄糖的毫克数，即可求出酶的比活性。（上述方法
5、制备的酶，其活性约每毫升20单位。）比活性(单位/mL)(生成葡萄糖的毫克数)/(酶的体积)4 蔗糖酶进程曲线的制作取200 mL 0.1 M的蔗糖溶液，在35水浴条件下恒温，加10 mL蔗糖酶溶液，每5分钟取出20 mL反应液加5滴5 M NaOH灭活后，测定一次体系的旋光度。求出葡萄糖的浓度，用葡萄糖的浓度对时间作图，得到蔗糖酶催化反应的进程曲线。时间（分）510152025303540旋光度葡萄糖浓度5 蔗糖酶米氏常数的测定 用缓冲溶液稀释0.5 M的蔗糖溶液成为一系列不同浓度的蔗糖溶液各50 mL，在35恒温条件下加入10 mL已知活性的蔗糖酶，反应5分钟，加入1 mL 5 M NaO
6、H溶液终止反应，测定此时溶液的旋光度，从而求出葡萄糖的生成速度V，根据米氏方程用反应速度V对（V/S）作图，直线的斜率-Km，直线的截距为Vmax，从而可以求出米氏常数Km。加入蔗糖体积(mL)蔗糖浓度（M）起始旋光度结束旋光度葡萄糖浓度（M）反应速度V(M/分)V/S11.200.0123.600.0337.200.06410.80.09514.40.12618.00.15721.60.18825.20.21五、 数据处理1 利用(3)中的数据计算酶的比活性。2 利用(4)中的数据作酶催化反应进程曲线。3 利用(5)中的数据计算蔗糖酶米氏常数。六、参考文献1 沈同等，“生物化学”，上册，人民
7、教育出版社，1980年版。2 复旦大学，“物理化学实验”，上册，人民教育出版社，1979年版。3 朱俭等，“生物化学实验”，上海科技出版社，1981年版。附录一直线直线方程一般可表示为：yabx（1）式中y和x为由实验数据可确定的量；a和b为待定参数或函数。例如，对Arrhenius公式指数式，y和x分别为lnk和1/T；a和b分别为lnA和（E/k）。对式lnr=lnknlnC，y和x分别为lnr和lnC；a和b分别为lnk和n。由于有实验误差，用n对由实验确定的yi与xi值作y对x图时，一般说来，所得各点并不严格的在同一直线上，于是存在着这样的问题：应如何更合理地作出直线，从而更准确地求解
8、a和b的值？应当指出，若直线选择不当（直线位置画的不当），不大的偏离，将可能导致a和b重大偏差。尤其是当试验测定的x区间范围相对较小时，外推至x0，将可使截距a产生较大的误差。例如依Arrhenius对数式以lnk对1/T作图，由实验测定的温度范围外推至1/T0，即T时，所选的直线斜率的较小的偏差将会引起截距lnA产生很大的偏差，致使指前因子A产生更大的偏差。怎样方能使直线位置选择（画）的得当呢？通俗地说，实测点（yixi）应均匀分布在直线两侧。严格的说，可采用下述“最小二乘法”确定最佳a、b值，作出最佳直线。若取得的数据实验值yi与xi（i=1、2、n），一般来说，yi与abxi值并不相等，
9、令其误差为di，则di=yiabxi线性回归，要求适当选择a与b之值，使各对元数据的偏差di之平方和之值为最小。即（2）（3）式中yi、bxi均为已知值。令与分别为yi与xi的平均值。则式（2）、（3）联立，可得（4）（5）由式（4）、（5）确定的a和b，称之为线性回归系数。用线性回归系数确定的直线方程yabx，称为回归直线方程。其对应的直线，称为回归直线。回归直线有下列性质1 当x时，由式（1）、（5）可知y，即回归直线必通过（，）点。2 由式（2）知，回归直线要求y的各次实验值yi与计算值abxi偏差之总和为零，即各实验点均匀分布于回归直线的两侧。欲度量一组实测点与回归直线的相符程度，常引
10、用所谓的相关系数“g”作为定量指标，其定义为：（6）当|g|值在01之间，|g|值越接近于1，表明该组实测点与回归直线吻合性越好。当|g|=1时，表示所有的实测点均严格地落在回归直线上；|g|E0。S等于底物的总浓度S减去被酶结合的S量（亦即ES），而ES的分解速度则是与二者之和为ES分解的总速度： （4）当整个酶反应体系处于稳态时，ES的形成速度与分解速度相等，即ES保持恒定，所以 k1(E0ES)S=k2ES+k3ES（5）令则（6）从而（7）因为酶反应的速度v与ES成正比，所以 v=k3ES（8）即（9）当底物浓度很高时，所有的酶都被底物所饱和，而转变成ES复合物，即E0=ES时，酶促反
11、应达到最大速度Vmax，所以Vmax=k3ES=k3E0（10）（9）式除以（10）式，得故（11）这就是米氏方程（Michaelis-Menten equation），Km为米氏常数（Michaelis-constant），该方程表明了当已知Km及Vmax时，酶反应速率与底物浓度呈正比的定量关系。当酶促反应处于v=1/2Vmax的特殊情况时，显然这里S=Km。由此可以看出Km值的物理意义，即Km值是当酶反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，它的单位与底物浓度的单位一样。Km是酶学研究中的一个极为重要的数据，下面再对Km作如下分析：（1） Km值是酶的特征常数之一，只与酶的性质有关，而与酶
12、的浓度无关。不同的酶，Km值不同，如苹果酸酶为0.05mmolL-1，脲酶为25 mmolL-1（2） 如果一个酶有几种底物，则对每一种底物，各有一个特定的Km值。Km值还受pH值及温度的影响。因此，Km值作为常数只是对一定的底物、一定的pH值、一定的温度条件而言。测定酶的Km值可以作为鉴别酶的一种手段。Km值随不同底物而异的现象可以帮助判断酶的专一性，并助于研究酶的活性中心。（3） 同一种酶有几种底物就有几个Km值，其中Km值最小的底物一般称为该酶的最适底物或天然底物。如蔗糖是蔗糖酶的天然底物。（4） Km不等于Ks，Ks是ES的解离平衡常数，由于，所以只有在特殊情况下（k1、k2k3，即形
13、成ES的平衡迅速建立，ES形成的速度大大超过ES分解为产物的速度）下，Km值才可看作Ks。1/Ks用来表示酶与底物亲和力的大小，1/Ks愈大，表示亲和力愈大。当k3极小时，可近似地用1/Km来表示酶与底物结合的难易程度，因为1/Km愈大，Km愈小，达到最大反应速度一半所需的底物浓度就愈小。显然，最适底物与酶的亲和力最大，不需很高的底物浓度就可以很容易地达到Vmax。（5） Km值与米氏方程的应用可由所要求的反应速度（反应达到Vmax的百分数），求出应当加入底物的合理浓度；反过来，也可以根据已知的底物浓度，求出该条件下的反应速度。例如，要求反应速度达到Vmax的90，其底物浓度应为则S=9Km根
14、据米氏方程，从酶的vS图上可以得到Vmax，再从1/2Vmax可求得相应的S，即Km值。实际上，即使用很大的底物浓度，也达不到真正的Vmax，从而也测不准Km值。为了准确地得到米氏常数，可用如下两种方法。（1） 双倒数作图法。米氏方程可改写为实验时选择不同的S测定相对应的v，以1/v对1/S作图，得一直线，外推至与横坐标相交，得图13中的“-x”值，即为1/Km，则Km=-1/x。这是求米氏常数最方便也是最常用的方法。图13 双倒数作图法（2） v对v/S作图，得一直线，如图14所示。该直线的斜率=-Km。根据米氏方程，以v对v/S作图，可得到与实验结果（见图12）相符的曲线。这种一致性，从一
15、个侧面反映了“中间产物假说”的正确性。几十年来，还积累了很多其他的依据，直接或间接地证明了中间产物学说的正确性。必须指出，现在的酶促反应动力学还只能较好地反映较为简单的酶作用过程，对于更复杂的酶作用过程，特别是对生物体中的多酶体系则还不能全面地概括和解释。米氏方程只假定形成一个ES，但实际上许多酶在催化时包括几个中间物过程，再加上许多酶促反应不只有一种底物，也不只产生一种产物，对这种过程的动力学分析是很复杂的，必须借助电子计算机才能进行计算。图14 v对v/S作图法3 酶的浓度对酶反应速度的影响在酶促反应中，如果底物浓度足够大，足以使酶饱和，则反应速度与酶的浓度成正比。从米氏方程（9）式即可看
16、出，当S维持不变时，vE。这里使用的酶必须是纯酶制剂或不含抑制物的粗酶制剂。4 pH对酶反应速度的影响大部分酶活力受环境pH的影响，在一定的pH下，酶反应具有最大的速度，高于或低于此值，反应速度便下降，通常称此pH为酶反应的最适pH，示例如图15。图15 胰蛋白酶活性与pH底关系酶的最适pH并不是一个常数，有时因底物种类、浓度及缓冲液成分不同而改变。动物酶的最适pH多在6.58.0之间，植物及微生物酶的最适pH多在4.56.5之间。（1） 过酸过碱会影响酶蛋白的构象，甚至使酶变性而失活。（2） pH会影响底物分子和酶分子以及中间产物ES的解离状态，往往只有某一种解离状态最有利于酶与底物的结合，
17、如果影响到ES的形成，酶的活性便降低了。（3） pH值影响分子中另一些基团的解离，这些基团的离子化状态与酶的专一性及酶分子中活性中心的构象有关。一般制作酶活性pH曲线时，采用使酶全部饱和的底物浓度，在此条件下再测定不同pH时的酶的活性。测活反应最好在缓冲液体系中进行。需要注意，酶在试管反应中最适pH与它在正常细胞的生理pH值不一定完全相同。5 温度对酶反应速度的影响温度与酶反应速度的关系，类似于pH与酶反应速度的关系，有一个最适温度。从温血动物组织中提出的酶，其最适温度在3540之间，植物酶则在4050。在达到最适温度之前提高温度，可加快酶促反应的速度，温度系数Q10多为12，即每增高10，酶
18、反应速度提高12倍。温度对酶促反应有两方面的影响。一方面是当温度升高时，反应速度加快；另一方面，随着温度升高而使酶逐步变性，即通过减少有活性的酶而降低酶的反应速度。酶反应最适温度就是这两种过程平衡的结果。在最适温度下，酶促反应符合阿累尼乌斯规律。大部分酶在60以上变性，而牛胰岛核糖核酸加热到100仍不失活。最适温度不是酶的特性物理常数，而是上述影响的综合结果。酶在干燥状态下，比在潮湿时对温度的耐受力要高。这一点已用于指导酶的保存。6 激活剂对酶反应速度的影响凡是能提高酶活性的物质，都称为激活剂，其中大部分是离子（金属离子、阴离子、氢离子）和简单有机化合物（如EDTA，半胱氨酸等），以及为对某些
19、无活性的酶原起作用的酶（）。7 抑止剂对酶反应的影响酶是蛋白质，凡是可以是酶蛋白变性而引起酶活性丧失的作用，称为失活作用。凡使酶活力下降，但并不引起酶蛋白变性的作用，称为抑制作用。所以，抑制作用与变性作用是不同的。能引起这种抑制作用的物质叫做酶的抑制剂，这里不予详述。四、 酶催化反应机理简述与酶的高效率有关的因素有如下几个方面;1 底物与酶的活性中心“靠近”与“定向”，酶受底物诱导发生构象变化，使底物与酶的活性中心楔合形成底物的转变态。2 酶使底物分子中的敏感键产生“张力”或“变形”，使敏感键易于破裂。3 某些酶与底物形成不稳定的共价的中间物，从而使底物迅速地转变为产物。4 酶活性中心的某些基团作为质子供体或质子受体而对底物进行“酸碱催化”。5 酶活性中心是低价电区域，大大有利于底物与酶的反应。具体讨论从略。参考文献1 沈同、俞梅敏等编著，生物化学上册，第五章，人民教育出版社，19802 鲁纯素、候新朴编著，生物物理化学，第八章，北京医科大学，中国协和医科大学联合出版社，199414