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1、实验一 质粒DNA的提取、酶切 及琼脂糖凝胶电泳,分子生物学实验,一 实验目的,掌握碱裂解法分离质粒DNA的基本原理和操作要点。 了解限制性内切酶作用的原理、特点和酶切质粒DNA的试验方法 学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术,质粒是一种染色体外能够稳定遗传的因子，具有双链共价闭环结构的DNA分子。是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。,二 实验原理,培养细菌使质粒扩增 收集和裂解细菌 分离和纯化质粒DNA 共价闭环DNA（cccDNA） 线状DNA（lcDNA） 开环DNA（ocDNA）,三个基本步骤,质粒存
2、的形态,碱裂解法利用宿主菌巨大线状染色体DNA与相对较小的闭环双链质粒DNA的结构的差异来提取质粒DNA。 碱变性DNA时，线状基因组DNA变性充分而质粒DNA处于拓扑缠绕的自然状态而不能彼此分开。当去除变性条件时（酸中和），质粒DNA迅速准确配置重新形成完全天然超螺旋状分子，而难于复性的长链线状的基因组DNA则与破裂的细胞壁、细菌蛋白相互缠绕成大型复合物，被SDS包盖，当K+取代Na+时这些复合物会从溶液中沉淀下来，附在细胞碎片上一起被离心除去。,质粒检测： 电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型。 吸光值检测：采用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光
3、值，若吸光值260nm/280nm的比值介于1.71.9之间，说明质粒质量较好，1.8为最佳，低于1.8说明有蛋白质污染，大于1.8说明有RNA污染。,型酶识别的DNA序列一般含有46个核苷酸。有的在识别顺序的对称轴上对双链DNA同时切割产生平末端；有的在识别顺序的双侧末端DNA双链产生粘性末端。型限制性内切酶需要Mg2+激活，大部分型酶所识别的序列具有反向对称的结构，或称为回文结构。 质粒DNA通常都具有一个或多个限制性内切酶酶切识别序列，可被相应限制性内切酶切出相应数量的切口，从而产生相应数量的酶切片断。 本实验采用的EcoR和Hind的识别序列和酶切位点分别为 GAATTC 和 AAGC
4、TT CTTAAG TTCGAA,DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。 在碱性环境下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的，把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小。 可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。共价闭环超螺旋DNA直线DNA开环的双链
5、环状DNA。,DNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNA的构象、所加电压、电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成。,琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.250kb之间,接含质粒的单菌落于2ml LB Amp+液体培养基中 370C，190rpm振荡培养过夜 取2.0mL菌液入2.0ml的dorf管中 5000rpm、离心5min，弃上清，收集菌体 200uL溶液I+5uLRNA酶悬浮菌体（充分混匀），冰上静置5min 加入400uL溶液II（轻轻混匀），室温静置5min裂解菌体 加入300uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置5min质粒DNA复性,三 实验步骤, 4 ，10000rpm，离
6、心10min，取700L（注不要吸到沉淀物）上清到一新管 加700L的 氯仿：异戊醇V:V24:1（混匀），冰上静置5min 4 ，10000rpm，离心10min，取500L（注不要吸到沉淀物）上清到一新管 加1.0mL无水乙醇（充分混匀），-20 放置20min 4 ，10000rpm，离心10min ，弃上清 加入500L 70%乙醇，将沉淀悬起 4，5000 r/min离心5min，弃上清（用软纸将管内乙醇吸干）即可。,取实验一中提取的质粒，向其中加入10L灭菌的双蒸水使其充分溶解，测定其dsDNA浓度。然后按下表进行操作：,充分混匀后于37保温2-3h。 （注最终反应体系中质粒浓度至少达到1.2g/L）,三 实验步骤,制胶 1.0 琼脂糖凝胶 (50ml) 凝胶板的制备 小心加入23lEB，摇匀（污染EB吸头，不宜再回收使用） 点样 样品20l，与4l溴酚兰混匀 ( DNA maker 3l 加入10l水与4l溴酚兰混匀) 电泳稳压 80v，DNA向阳极移动, 大约50-60min 观察和拍照254nm紫外灯下观察,四 实验结果,五 注意事项,质粒提取过程必需缓和，不能剧烈振荡。 操作过程避免污染，反应体系中各试剂用量准确。 EB是一种诱变剂，操作时必须戴塑料或乳胶手套!,