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1、休哈塔假丝酵母发酵木糖产乙醇的研究第22卷第4期安徽工程科技学院2007年12月JournalofAnhuiUniversityofTechnologyandScienceVo1.22.No.4Dec.2007文章编号:16722477(2007)04-002504休哈塔假丝酵母发酵木糖产乙醇的研究周逢云,汤斌,张庆庆,陈阿娜,翟光雯,陈中碧(安徽工程科技学院生物化学工程系.安徽芜湖241000)摘要:对休哈塔假丝酵母初始菌株经过驯化筛选出一株Tz一8高产酒精菌株,研究了木糖初始浓度,温度,转速以及pH值对Tz一8菌株发酵产乙醇的影响.实验结果表明,最适发酵条件是木糖初始浓度为40g/L,温度
2、为3O,转速9O一110r/min.初始pH4.55.0,乙醇产量为11.02g/L.木糖利用率达到86.9.关键词:休哈塔假丝酵母;木糖;发酵;乙醇中图分类号:Q815文献标识码:A燃料乙醇作为替代能源之,与普通汽油相比,具有燃烧更完全,CO排放量较低,燃烧性能与汽油相似等优良特性,被公认为21世纪绿色能源.传统酒精是利用淀粉质原料发酵得到,而利用生物质为原料生产燃料乙醇,具有原料来源丰富,价格低廉等优点,是生产乙醇的理想选择.不仅可以解决人类所面临的能源危机,废弃物对环境的污染以及可以缓解利用淀粉转化酒精所造成的粮食危机,具有巨大的经济效益和社会效益l_j.在植物纤维素中,纤维素,半纤维素
3、,木质素的含量比为4:3:3,天然半纤维素如木聚糖水解产物的8590是术糖.因而木糖发酵产乙醇是生物转化木质纤维素得以实现的关键环节之一4j.自从1980年.Wang等人5提出木糖可被一些微生物发酵产乙醇以来,目前已发现能利用木糖的菌种有两百多种,但能发酵木糖产乙醇的菌种就几十种,而被认为最具有工业价值的菌种为休哈塔假丝酵母(Candidashehatae),嗜鞣管囊酵母(Pachysolentannophilus),树干毕赤酵母(Pichiastipitis)6.本文选取木糖为碳源,初步研究休哈塔假丝酵母的生长及其发酵性能,为实现生物转化木质纤维素生产燃料乙醇奠定基础.1材料与方法1.1菌种
4、休哈塔假丝酵母1766(Candidashehatae):中国工业微生物菌种保藏中心提供.1.2培养基木糖固体培养基:木糖20g/L,蛋白胨5g/L,酵母浸出汁3g/L,琼脂20g/L.木糖固体驯化培养基:木糖20g/L,酵母浸出汁3g/L,(NH)SO10g/L,琼脂20g/L.木糖液体培养基:木糖20g/L,蛋白胨5g/L,酵母浸出汁3g/L.木糖发酵培养基:木糖40g/L,酵母浸出汁3g/L,(NH)SO10g/L,KHPO2g/L,MgSO1g/L.1.3实验方法(1)休哈塔假丝酵母菌株的驯化分离.将休哈塔假丝酵母在木糖为唯一碳源的驯化培养基上连续传代培养后,无菌操作下挑取休哈塔假丝酵
5、母,梯度稀释至10,10_.,10后涂布到木糖固体培养基上,观察酵母生长状况,选取生长较快,菌落饱满的单菌落进行分离纯化,将纯化后的菌株转接到木糖固体培养基斜面上,30.C培养3d后置冰箱保存.将所筛选出的菌株接种发酵,根据产乙醇能力选育出产乙醇能力强的菌株.(2)木糖初始浓度对休哈塔假丝酵母发酵的影响.将筛选出的菌株分别接种到木糖质量体积比为2,3,4,5,6的发酵培养基中,接种量为10,在30,摇床转速为90r/min下发酵48h,测定收稿日期:20070803基金项目:安徽省高校自然科学基金重点资助项目(kj2007a018)作者简介:周逢云(1982一),男,安徽芜湖人,硕士研究生;汤
6、斌(1956一),男,安徽桐城人,教授,硕导.?26?安徽工程科技学院2007年乙醇浓度,残糖含量,pH值及菌体OD值.(3)温度对休哈塔假丝酵母发酵木糖的影响.将筛选出的菌株接种到木糖发酵培养基中,接种量为10,温度分别在22,26,30,34,38,摇床转速为90r/min下发酵48h,测定乙醇浓度,残糖含量,pH值及菌体OD值.(4)摇床转速对休哈塔假丝酵母发酵木糖的影响.将筛选出的菌株接种到木糖发酵培养基中,接种量为10,250mL的三角烧瓶中发酵液为50mL,在30,摇床转速分别为5Or/min,70r/min,90r/min,110r/min,130r/min下发酵48h,测定乙醇
7、浓度,残糖含量,pH值及菌体OD值.(5)初始pH值对休哈塔假丝酵母发酵木糖的影响.将筛选出的菌株接种到木糖发酵培养基中,调pH分别至3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,接种量为10,在30,摇床转速90r/min下发酵48h,测定乙醇浓度,残糖含量及菌体OD值.1.4分析方法(1)发酵液中乙醇含量的测定:重铬酸钾法7.(2)发酵液中木糖含量的测定:DNS法8.(3)发酵液pH值的测定:利用PHSJ一4A实验室pH计测定.(4)休哈塔假丝酵母发酵液中菌体浓度的测定:取发酵液1mL稀释至5mL,以同样条件的灭菌培养基为空白,用TU一1800PC紫外可见分光光度计测600nm下OD值.
8、2结果与讨论2.1休哈塔假丝酵母菌株的驯化分离取培养4d,菌落较大的菌株转接后接种发酵,以乙醇产量和木糖利用率为指标,从38株中选取发酵性能较好的菌株TZ一8作为后续研究菌株.筛选前和筛选后的菌株发酵性能情况见表l,结果显示乙醇产量提高了30.56,木糖利用率(消耗的木糖与总糖质量比)提高幅度为6.18表1驯化前与驯化后菌株的发酵性能2.2木糖初始浓度对休哈塔假丝酵母发酵的影响初始木糖质量分数对Tz一8菌体发酵的影响结果如图1,2所示.当初始木糖质量体积比为40g/L时,乙醇产率(消耗每克木糖产乙醇克数)最高,为0.31lg/g,乙醇产量在初始木糖质量体积比达到40g/L时达到最大值为11.0
9、2g/L,木糖的利用量随木糖初始浓度升高而升高,说明木糖质量体积比对TZ一8菌株的木糖利用没有显着影响.TZ一8菌体在发酵的过程中伴随着生长的过程,当木糖初始浓度为40g/L时最高,OD值为1.146.终时的pH下降,主要由于氮源(NH).SO被利用时分解成酸性物质,以及发酵产酸所至,酸性物质如乙酸对发酵产乙醇有抑制作用.1oo9o毒80匠70薹605040祷址话1.400.8一犍o.2翘0图1初始木糖质量体积比对发酵性能的影响图2初始木糖质量体积比对菌体生长及终pH的影响2.3温度对休哈塔假丝酵母发酵木糖的影响温度是发酵过程中的重要参数,酵母菌发酵温度一般在3032.本文研究了温度对发酵木糖
10、产乙醇的影响,结果如图3,4所示.温度为30时,乙醇产率最高为0.317g/g,2630,乙醇产量,木糖利第4期周逢云,等:休哈塔假丝酵母发酵木糖产乙醇的研究用率以及菌体生长情况都非常接近,高于30时,温度对TZ一8菌株发酵产乙醇及生长的抑制作用随温度的升高而增强.图3温度对发酵性能的影响褥磁图4温度对菌体生长及终pH的影响1.41.21j璺0.800.6毪o.4避0-2羞02.4摇床转速对休哈塔假丝酵母发酵木糖的影响酵母发酵木糖产乙醇是在半厌氧状态下进行的.J.R.Kastner等人.研究了溶氧对休哈塔假丝酵母发酵木糖的影响,结果表明氧的缺乏会导致以木糖为底物的菌体死亡.同时氧在木糖发酵产乙
11、醇有两个方面的作用,一是氧的增加可以减少木糖醇的产量,二是氧又会氧化乙醇而产生乙酸,乙酸对发酵有毒害作用.由于这两个相反的作用,因而选择一个最佳的含氧条件显得非常重要n.本研究通过摇床转速间接来控制发酵过程中的溶氧.结果如图5,6所示,随着转速的提高,菌体生长加快,所产生的酸性物质也变多,残糖含量减小;当转速为110r/min时,残糖仅为0.61g/L;转速为90r/min时,乙醇产量达到最高值为10.89g/L;转速为130r/min时乙醇产量已下降到7.49g/L.1()0堡80茎o薹o*20()507090l10130转速/fr?rain)图5摇床转速对发酵性能的影响0.350.30.2
12、5婷0.20.15焉0.13?532.5詈21.5l0?50图6摇床转速对菌体生长及终pH的影响一j粤00,一越避蛙:I翟2.5初始pH值对休哈塔假丝酵母发酵木糖的影响pH值是发酵过程中关键参数之一,有效的控制可以提高乙醇的产量.结果如图7,8所示,随着初始pH值的升高,残余木糖质量体积比变大,pH值为6.0时,木糖利用率仅为62.99,6.pH值为4.55.0时,乙醇产量和菌体浓度达到最高,分别为10.8g/L和1.146g/L,说明酵母生长和发酵的最佳初始pH为4.55.0.终时pH值随初始pH值升高而升高.潞L避一j砻00,一划基斑图7初始pH值对发酵性能的影响图8初始pH值对菌体生长及
13、终pH的影响3结论通过对休哈塔假丝酵母初始菌株筛选出一株TZ一8高产菌株,其最适发酵条件是木糖初始浓度为40g/L,温度为30,转速90110r/min,初始pH4.55.0,在此条件下乙醇产量为11.02g/L,木糖利用率为86.9.从研究的结果来看,仍存在发酵木糖底物浓度不高,乙醇产率偏低以及发酵时间过长等主要?28?安徽工程科技学院2007芷问题,因而仍需进一步研究以提高底物浓度,乙醇产率以及缩短发酵时间等问题.参考文献1E2E34EsE6E7891OYanLin?ShuzoTanaka.Ethanolfermentationfrombiomassresources:currentsta
14、teandprospectsJ.AppliedMicrobiologyandBiotechno1ogy,2006,69(6):627642.陈新芳.田沈,王菊.等.提高木糖和葡萄糖乙醇产率的菌种驯化J.太阳能.2005,26(2):215218.牟建楼.王颉,张伟,等.木糖发酵微生物的研究进展J.纤维索科学与技术,2004,12(2):3541.钟桂芳,傅秀辉,孙君社.等.发酵木糖生产酒精的研究进展及其应用前景J.微生物学杂志,2004,24(1):4246.WangPY,ShopsisC,SchneiderH.FermentationofapentosebyyeastsJ.BiochemBi
15、ophysResCommun,1980,94:248254.EMLohmeier-Vogel.CRSopherandHLee.Intracdlularacidificationasamechanismfortheinhibitionbyacidhydrolysis.derivedinhibitorsofxylosefermentationbyyeastsJ.JournalofIndustrialMicrobiologygBioteehnology,1998.20:7581.牟建楼.王颉.张伟,等.乙醇的测定方法综述J.酿酒.2006,33(2):4648.张龙翔.生化试验方法和技术M.北京:人
16、民教育出版社,1981:2223.JR.Kastner.WJJones.RSRoberts.OxygenstarvationinducescelldeathinCandidashehataefermentationsofd-.xylose.butnotd-glcoseJ.AppliedMicrobiologyandBiotechnology.1999.51(6):780785.YongSuJin,ThomasWJefffies.StoichiometricnetworkconstraintsonxylosemetabolismbyrecombinantSaeeharomycescerevisi
17、aeJ.MetabolicEngineering,2004(6):229238.EthanolproductionofxylosefermentationbyCandidashehataeZHOUFengyun,TANGBin,ZHANGQingqing,CHENAna,ZHAIGuangwen,CHENZhongbi(Dept.ofBioch.Engn.AnhuiUniversityofTechnologyandScience,Wuhu241000.China)Abstract:Bydomesticating,separatingandcultivatingfrominitialCandid
18、ashehatae,anexcellentstrainTZ-8wasattained.Theeffectsofthexylosemassconcentration,thetemperature,therotatingspeedandtheinitialsubstratePHvalueonthefermenlationwerestudied.Theresultsindicatedthattheoptimumconditionswerethatthexylosemassconcentrationandthetemperatureshouldbe40g/Land30,therotatingspeedandtheinitialsubstratepHvalueshouldbekeptbetween90and110r/minand4.55.0respectively,.Undertheoptimumcondition,theethanolyieldwas11.02g/Landtherateofutilizingxylosearrivedat86.9.Keywords:Candidashehatae;xylose;fermentation;ethanol