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1、1,罗非鱼鱼骨胶原蛋白分离纯化实验方案,课 程名称：微生物 指导老师：林莹 教授 实验组成员：黄欣欣、林静、颜明月、蔡达、胡丽琴,2,一、理化性质 二、实验器材 三、提取分离 四、SDS-PAGE,目 录：,3,物理性质： （1）等电点：在某一pH溶液中表现出不带电荷，呈两性离子状态，即所带正电荷和负电荷相等（零电荷），这一pH称为蛋白质的等电点。 （2）溶解性：胶原蛋白往往出现两个等电点，一个在pH 4.5 5.0；另一个在pH 6.8 8.0，所以胶原蛋白会出现两个最低溶解度。,胶原蛋白理化性质,4,化学性质： （1）两性电解质：pHpI时，蛋白质带负电，向阳极移动；ph=pI时，蛋白质不
2、带电，不移动。 （2）酸碱膨胀：胶原肽链间的氢键和离子键乃至共价键在酸或碱的作用下有所破坏，使胶原结构松散。 （3）盐的作用：胶原在盐溶液中会发生其肽链间的离子键被盐解离的阴、阳离子打开，从而吸水膨胀。 （4）显色反应：茚三酮反应、双缩脲反应、酚试剂反应,罗非鱼鱼骨胶原蛋白介绍,5,罗非鱼骨基本成分 鱼排蛋白质中有80%的胶原蛋白，主要为I型胶原蛋白，II型胶原蛋白可以从软骨中提取得到。其中I型至少有两种肽链（ 1和 2）组成，它们的分子大小、亚基构成很相近，含有大量肽链， 1含量接近含量， 1分子量约为130 kDa， 2分子量约为118 kDa， 分子量约为200 kDa。,6,二、分离纯
3、化,材料、药品及仪器 实验方案,7,材料、药品及仪器：,新鲜罗非鱼（市售）、乙酸、柠檬酸、氯化钠、EDTA、乙醚、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂、蛋白质标准品、猪胰蛋白酶等(均为分析纯) 电子天平、粉碎机、冷冻干燥机、电热恒温水浴锅、UV 分光光度计、高速冷冻离心机、聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳装置等。,实验流程：,鱼排清除残余鱼肉,清水清洗晾干,脱脂,去除盐,去除杂蛋白,所有过程在10下进行，防止变性,提取,精制,胶原,9,1、鱼骨脱脂工艺,取50g粉碎的鱼骨加入物料比为1:20的乙醚在4下浸泡1d。,10,2、鱼骨脱盐去杂工艺,取50g左右脱脂后的鱼骨粉，加入其质量5倍的0.5mol/L EDT
4、A溶液（pH 7.4）于4下浸泡5 d，每天更换一次EDTA溶液，用蒸馏水反复洗涤，再以其质量20倍的 0.1mol/L NaOH溶液4下浸泡12小时，再用蒸馏水冲洗至中性。,除去非胶原蛋白及防止内源性蛋白酶对胶原蛋白的影响,脱钙作用,11,3、胶原的提取,鱼骨经脱盐去杂后，加入等量的0.5mol/L乙酸溶液并在4下浸泡3d，提取液中含有1%的胃蛋白酶，5000r/min离心20分钟去除杂质，收集上清液，即得到胶原粗提液。提取过程不断搅拌。,酸溶性胶原,切去末端肽，使三螺旋结构的主体部分溶解在稀酸中,12,4、胶原的精制工艺,粗提液缓慢加入氯化钠粉末，使其终浓度达到0.9 mol/L，盐析过夜
5、，5000r/min离心20分钟，弃去上清液，沉淀用10倍体积0.5mol/L的乙酸溶液溶解，5000r/min离心20分钟去除杂质，上清液再次重复盐析、离心，溶解操作，最后用蒸馏水透析3天，每天更换透析液，冻干即得胶原精制品。,13,四、检测方法,SDS-PAGE电泳 原理：利用SDS这种阴离子去垢剂，SDS带有大量的阴离子，SDS和蛋白质分子结合后形成长柱形的复合物，SDS在外侧，蛋白质分子在内测，从而使得和蛋白质分子的电泳速度唯一有关系的是蛋白质分子量。 蛋白质浓度：Folin-酚试剂法 原理：Folin试剂中的磷钼酸-磷钨酸盐被蛋白质中的色氨酸 和酪氨酸残基还原，发生显色反应：产生蓝色（钨兰+钼兰）。蓝色的浓重度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定。,Thank you!,15,