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1、TRAIL联合顺铂诱导卵巢癌耐药细胞株COC1/DDP凋亡机制的研究【摘要】 目的：研究TRAIL联合顺铂对卵巢癌耐药细胞COC1/DDP生长的影响，以及联合用药对TRAIL死亡受体（DR4、DR5）、凋亡相关基因Smac、Survivin表达的影响，揭示TRAIL联合顺铂可能逆转COC1/DDP细胞耐药性的机制。方法：采用MTT法检测不同浓度TRAIL蛋白与DDP联合用药对COC1/DDP细胞生长的影响，用Annexin V-FITC法检测COC1/DDP细胞凋亡，用RT-PCR方法检测DDP对TRAIL受体（DR4、DR5）、凋亡相关基因Smac、Survivin表达。结果：TRAIL蛋白
2、对COC1/DDP细胞生长有抑制作用，DDP与TRAIL蛋白联合作用后细胞生长抑制率显著升高（P0.05）。DR5表达水平较对照组明显升高，DDP 2 μg/mL组为对照组的3.45倍（P0.05）。Smac表达渐次增加，DDP 2 μg/mL组为对照组的2.82倍（P0.001）。3 讨论肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体TRAIL是TNF超家族的新成员。TRAIL通过与死亡受体（death receptor，DR）的功能受体DR4、DR5结合，能特异性杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞无明显毒性，与FasL和TNF-α对多种组织细胞有毒性相比，TRAIL在肿瘤治疗方面具有更好的
3、应用前景。目前普遍接受的TRAIL凋亡诱导途径有两条，即线粒体依赖型途径和线粒体非依赖型途径。I型为线粒体非依赖型途径，即活化的caspase-8直接激活下游效应蛋白caspase-3、caspase-6、caspase-7而诱导凋亡。型为线粒体依赖型途径，活化的caspase-8促使Bid催化断裂形成有活性的截短Bid（tBid）并定位于线粒体膜，引起线粒体跨膜电位降低或破坏，促使线粒体释放细胞色素c、促凋亡蛋白Smac和dATP结合形成凋亡酶体（apoptosome），进而活化效应蛋白，最终导致细胞凋亡。本实验通过MTT法证实TRAIL蛋白可抑制COC1/DDP细胞生长，与DDP联合用药的
4、抑制率高于同一浓度单纯TRAIL和DDP抑制率之和，提示两者联合对COC1/DDP细胞可能有协同抑制增殖作用。流式细胞仪Annexin V-FITC法检测细胞凋亡结果说明这种抑制作用部分源于两者的促凋亡作用。RT-PCR检测结果表明经过DDP处理后COC1/DDP细胞DR5表达增加，且可能通过线粒体途径中促凋亡蛋白Smac表达增加导致细胞凋亡。COC1/DDP是将人卵巢浆液性腺癌细胞通过DDP浓度间歇诱导，最终获得能完全耐受1.0 μg/mL DDP的细胞亚株。由于TRAIL诱导细胞凋亡途径不同于DDP的作用机制，TRAIL是通过与细胞表面受体DR4和DR5结合引起肿瘤细胞凋亡，这与DD
5、P、TXAL等常规化疗药物作用机制完全不同。Arts等通过检测发现化疗后残瘤肿瘤组织中DR4、DR5的表达较化疗前更强，认为这种变化可能是因化疗引起。本研究结果表明在2 μg/mL的DDP作用下COC1/DDP细胞抑制率仅为3.58%，提示对DDP耐药，联合用药的抑制率明显增加，高于同一浓度单纯TRAIL和DDP抑制率之和。DDP处理后DR5水平增加，会明显增强TRAIL促凋亡的作用，可以用来解释TRAIL可能逆转COC1/DDP细胞对DDP的耐药性。Survivin通过抑制caspase-3的表达而阻止细胞过度凋亡，本研究中DDP处理后Survivin表达减少，是否可能导致caspas
6、e-3的表达增加进而促进细胞，尚需进一步实验予以证实。Smac是存在于线粒体中并调节细胞凋亡的蛋白质，本研究中DDP处理后，Smac表达增加，推测DDP处理后COC1/DDP细胞DR5表达增加，可能通过线粒体途径导致细胞凋亡。参考文献【1】 Jemal A，Siegel R，Xu J，et al.Cancer statistics，2010.CA Cancer J Clin，2010，60（5）：277-300.【2】 Pitti R M，Marsters S A，Ruppert S，et al.Induction of apoptosis by Apo-2 ligand， a new mem
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