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1、RNA干扰iNOS基因对腺样囊性癌细胞增殖活性的相关探讨涎腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma， SACC）是口腔颌面部常见的涎腺恶性肿瘤之一，约占涎腺恶性肿瘤的24%【1】。而且腺样囊性癌具有嗜神经侵袭和肺高转移等特殊的生物学行为。腺样囊性癌对于放疗以及化疗均不敏感，目前仍以手术治疗为主。腺样囊性癌短期预后较好，但远期生存率下降明显。远处转移尤其是肺转移是此类患者的主要致死病因之一。一氧化氮（nitric oxide， NO）是由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase， NOS）催化底物左旋精氨酸合成的一种具有多种生物学活性的气体
2、分子。NOS有3种亚型，分别由不同的基因编码，即神经元型NOS（neuronal， nNOS）、诱导型NOS（inducible NOS， iNOS）和内皮型NOS（endothelial， eNOS）。其中又以iNOS是NO合成的关键酶而且与肿瘤发生发展关系最为密切，它广泛存在于人和哺乳动物的许多细胞中，而在肿瘤细胞中表达明显升高，如乳腺癌细胞、肝癌、肺腺癌细胞、腹膜癌、黑色素瘤和口腔鳞癌【2】，本实验拟通过干扰iNOS合成，研究iNOS影响腺样囊性癌的增殖能力。1 材料与方法1.1 细胞培养 腺样囊性癌细胞系高转移株（ACC-M）由中山大学附属孙逸仙医院李劲松教授馈赠。细胞培养于10%的F
3、BS、100 U/ml青霉素和0.1 mg/ml链霉素的DMEM培养液，置于37 ，5%（v/v）CO2饱和湿度恒温培养箱中培养。细胞为贴壁生长0.25%的胰酶消化传代。1.2 特异性si iNOS序列 转染腺样囊性癌鳞癌细胞株iNOS-siRNA由广州赛哲生物科技公司设计并合成，经预实验选用特异性iNOS的基因序列见表1。1.3 实验方法1.3.1 基因转染 转染前一天将ACC-M分为si-1，si-2，si-3，si-NC（阴性对照）和MOCK（空白对照）五组，培养基换成不含抗生素的培养基（美国hyclone）；转染当天，细胞汇合率达到70%以上；吸去旧的培养基，用PBS轻洗2次，每孔加入
4、1.6 ml无血清培养基，置于5%CO2、37 培养箱中；取浓度为20 μm的siRNA/microRNA2 μl，加入400 μl无血清培养基中，混匀后，加入4 μl Turbofect siRNA transfection reagent，混匀后在室温下孵育1520 min。每孔加入上述孵育好的转染复合液400 μl，置于5%CO2、37 培养箱中培养46 h后换成正常的完全培养基。转染后2448 h，检测RNA表达水平。1.3.2 实时荧光定量PCR检测 iNOS引物的设计见表2。TRIzol法提取细胞株中总的RNA，cDNA的合成采用M-MLV反转录试剂盒
5、（Promega）。将合成的cDNA 2 μl加入25 μl反应体系中，在荧光实时定量PCR仪上检测。25 μl反应体系中包括：10xPCR缓冲液2.5 μl，MgCl2 0.75 μl，2 μl 10 mmol/L的dNTPs，1 μl 10 mmol/L的iNOS和VEGF的上下游引物，0.25 μl 5 U/μl的Taq DNA聚合酶，双蒸水17.5 μl。PCR反应条件：预变性95 ，15 s；变性95 ，5 s；退火延伸60 ，30 s，共45个循环。1.3.3 MTT法检测细胞增殖活性 在96孔板中接种细胞（5000个/孔
6、），每孔100 μl。将96孔板放在培养箱中培养（37，5%CO2）。24 h后使用turbofect siRNA transfection进行转染。转染24 h、48 h、72 h后向每孔加入10 μl的CCK-8溶液。将培养板在培养箱内孵育1.5 h。用酶标仪测定在450 nm处的吸光值。1.4 统计学处理 应用SPSS 13.0统计学软件对数据进行处理，组间进行单因素的LSD-t检验，以P0.05为差异具有统计学意义。2 结果2.1 RT-qPCR检测结果 ACC-M胞中基因的qPCR产物，在转染后实验si-1组与si-2，si-3，si-NC（阴性对照）和MOCK（空白对照
7、）五组iNOS表达比较差异有统计学意义（P0.05），实验数据的设定见图1。2.2 iNOS表达下调能够有效抑制腺样囊性癌细胞的增殖活性 根据以上结果选取si-1组进行细胞增殖活性实验。利用iNOS的siRNA对ACC-M细胞中iNOS的表达进行抑制，利用MTT法检测ACC-M细胞的增殖活性。结果显示：在ACC-M细胞中抑制iNOS的表达48 h和72 h时实验组的细胞增殖活性明显受到抑制，与24 h比较差异有统计学意义（P0.05）。细胞增殖活性的变化见图2。3 讨论NO既具有第二信使和神经递质的功能，又是杀伤肿瘤细胞的效应分子，在肿瘤的发生发展中具有杀伤和促进肿瘤生长的双刃剑;作用。一般认
8、为如果肿瘤体积在小于12 mm3时候没有新生的毛细血管和小血管长入，肿瘤就会发生消退，Thomesen等【3】曾经报道，在乳腺癌、胃癌中，iNOS催化产生低水平的NO（比引起瘤细胞死亡的浓度低12数量级），为肿瘤发展创造有利的微环境。因此在肿瘤微血管的形成过程中，iNOS可能起着促血管生成的作用。从而促进了肿瘤的发生发展。而且现在已经知道的很多肿瘤组织都有iNOS蛋白的表达【4】。在笔者以往的研究中发现iNOS在腺样囊性癌中存在着高表达，因此在本实验中在利用ACC-M细胞株沉默了iNOS后检测到ACC-M增殖活性降低。这印证了iNOS可以调控ACC-M的生长是潜在的靶基因。但iNOS通过什么机
9、制调控肿瘤的发生发展？以往的研究表明，Gallo等【5】发现在头颈肿瘤中诱导型NOS与微血管密度（microvessel density，MVD）的表达成正相关，提示iNOS可以诱导癌组织中NO的形成，从而促进肿瘤的侵袭生长。Jenkins【6】将iNOS基因转染到人结肠腺癌细胞株中使其产生NO，成为iNOS-19细胞克隆。在裸鼠体内iNOS-19肿瘤快速生长，在iNOS-19肿瘤中出现较多的新生血管。本研究通过下调iNOS的表达抑制腺样囊性癌细胞株的增殖能力。揭示了iNOS调表达影响腺样囊性癌增殖的关系，针对iNOS信号通路进行深入研究，对帮助解决iNOS恶性肿瘤基因治疗效果不佳的问题及肿瘤
10、的基因治疗产生一定的影响。参考文献【1】马大权.涎腺腺疾病.北京：人民卫生出版社，2002：211-239.【2】 Brennan P A，Palacios-Callender M，Umar T， et al.Expression of type 2 nitric oxide synthase and p21 in oral squamous cell carcinoma.Int J Oral Maxillofac Surg，2002，31（12）：200-205.【3】 Thomesen L L，Miles D W. Role of nitricoxide in tumor progress
11、ion： lesions fromhumantumors. Cancer Metastasis Rev， 1998，17（4）：107-118.【4】 Ellie E，Loiseau H，Lafond F， et al. Differential expressionof inducible nitric oxide synthase mRNA in human braitumours.Neuroreport，1995，7（1）：294-296.【5】 Gallo O，Masini E，Morbidelli L，et al. Roles of nitric oxidin angiogenesis and tumor progressionin head and neck cancer.J Nati Cancer Inst，1998，90（8）：541-549.【6】 Jenkins D C，Charles I G，Thomsen L L， et al.Roles of nitric oxidein tumor rowth.Proc Natl Acad Sci USA，1995，92（10）：4392-396.