茶多酚大孔树脂吸附分离性能的研究.doc

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1、茶多酚大孔树脂吸附分离性能的研究1 材料与仪器1.1 材料：茶叶( 有限公司) (经西北大学生命科学学院植物教研室鉴定);1.2试剂及药品：茶多酚对照品(批号： ，中国药品生物制品检定所提供);大孔树脂LX-X由西安蓝晓科技开发有限公司提供。其它试剂均为分析纯。1.3 仪器：岛津LC-20A型高效液相色谱系统：包括LC-20A型高压恒流泵、SPD-20A检测器和LC Solution工作站；UV -762紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);电热恒温水浴锅(HHS21-6C，上海医疗器械五厂);电子分析天平(FC204，上海精科实业有限公司);旋转蒸发器R50 2B (上海亚蓉生化仪

2、器厂);SHZ-D()循环水式真空泵；索式提取器；电热鼓风干燥箱;植物粉碎机(FZ102，天津市泰斯特仪器有限公司)；层析柱(40 mm50 cm)。2 方法2.1茶多酚的定性、定量检测2.1.1茶多酚的薄层定性检测硅胶薄板制作按1：3的比例称取硅胶G和0.5%的CMC-NA，研磨约30min后，平铺到1020cm的洗净烘干的玻璃平板上，铺匀，隔夜，自然晾干。展开剂配制按氯仿：乙酸乙酯：正丁醇：甲酸 = 2：1.3：0.4：0.3的比例配置（约需80ml）层析活化薄板：105，30min。点样：所用液体为留取的待测液，点样量为25uL。饱和：在层析缸内扣放入一培养皿，再将薄板放在上面,板子不接

3、触层析液，在其蒸汽中饱和30min以上。层析：将板子放入展开剂中展开，待展开剂前沿距板子上端1.5cm取出，放入通风厨晾干。结果观察及分析:（肉眼观察）2.1.2茶多酚的定量测定酒石酸亚铁分光光度法1利用茶叶中的多酚类物质能与亚铁离子形成蓝色络合物的性质，将茶叶水提液及树脂法、有机溶剂法所得产品配制成一定浓度的溶液，使其与酒石酸亚铁溶液在一定的介质条件中反应生成蓝色络合物，通过测定络合物的吸光光度值，利用公式便可以算出茶叶及各产品中茶多分的含量。仪器及用具实验室常规仪器及感量0.0001的分析天平、分光光度计2.1.2.1试剂和溶液1） 酒石酸亚铁溶液：准确称量0.500克硫酸亚铁（FeSO4

4、7H2O）和2.500g酒石酸钾钠（C4H4O6KNa4H2O），用水溶解并定容至500ml。（溶液低温、避光保存，有效期一个月）2） PH=7.5的磷酸盐缓冲液1/15M磷酸氢二钠：称取11.6885g磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O），用水溶解并定溶至500ml。1/15M磷酸二氢钾：称取4.5390g磷酸二氢钾（KH2PO412H2O），用水溶解并定溶至500ml。取上述1/5磷酸氢二钠溶液85ml和1/15M磷酸二氢钾溶液15ml，混匀即可。2.1.2.2操作方法试样制备：称取3g茶叶，研碎后，将其放置于500ml的锥形瓶中，加沸蒸馏水450ml，立即移入沸水浴中，浸提45min，

5、浸提完毕后立即趁热减压过滤，滤液移入500ml容量瓶中，残渣用少量热蒸馏水洗涤23次，并将滤液移入上述容量瓶中，冷却后用蒸馏水稀释至刻度。称取多酚产品各0.025g，用甲醇溶解并定容至25ml，溶液浓度为0.1%。测定步骤：a. 吸取上述试样液各1ml，分别加入已标号的25ml容量瓶中，然后各加入4ml水，5ml酒石酸亚铁溶液，充分混匀后用PH=7.5磷酸盐缓冲液定溶至计刻度线。b. 不加试样液，配制试剂空白溶液，以作参考。c. 用10ml比色杯，在波长540nm处测定各溶液的吸光度A。测定结果如表1：2.1.2.3结果计算茶叶及茶多酚产品中的茶多酚含量，以干物质量百分率表示：计算公式为： A

6、1.9572L1茶多酚（%）= 100 1000L2Mm 其中： L1试剂的总量（ml） L2测定时用液量（ml） M试样的质量(g) m试样干物质含量百分率（%） A试样的吸光度 1.957用10mm比色杯，当吸光度等于0.50时，每毫升茶汤中茶多酚相当于1.957mg。 0.2391.957225茶多酚产品（%）= 100%=93.54% 100010.025 2.1.2.4结果讨论2.1.3茶多酚的定量测定酒石酸亚铁分光光度法21 原理利用茶叶中的多酚类物质能与亚铁离子形成蓝色络合物的性质，将茶叶水提液及三种提取法所得的产品配制成一定浓度的溶液，使其与酒石酸亚铁溶液在一定的介质条件中反应

7、生成蓝色络合物。通过测定此络合物的吸光度值，利用由没食子酸乙醋作为对照品制作的标准曲线便可计算出茶叶及各产品中茶多酚的含量。根据茶多酚主要成份是表儿茶素和表没食子儿茶素类。儿茶素结构的羟基在苯核上的位置不同，既有邻苯二酚基，又有连苯三酚基，还有没食子酸形成酯型结合物。而酒石酸亚铁主要是与茶多酚中的邻位羟基和连位羟基功能团显色，而对间位羟基和单羟基不显色。以没食子酸丙醋为测定标准，它具有邻位酚性羟基和连位酚性羟基的特点，又具有羟丙酯基，更能代表儿茶素为多种酚类的实际情况。在pH7.5波长540nm, lcm比色皿条件下用酒石酸亚铁法lmg没食子酸丙酯吸光度相当于I.5mg茶多酚的吸光值。也就是说

8、换算系数为1.5，这种测定法较科学，又易于掌握。2 仪器和用具实验室常规仪器及感量0.0001g的分析天平、分光光度仪。3试剂和溶液1）酒石酸亚铁溶液：准确称取0.5000g硫酸亚铁（FeSO47H2O）和2.5000g酒石酸钾钠（C4H4O6KNa4H2O），用水溶解并定容至500ml。（溶液低温、避光保存，有效期一个月）2） PH7.5的磷酸盐缓冲液1/15M磷酸氢二钠：称取11.9380g磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O），用水溶解并定容至500ml。1/15M磷酸二氢钾：称取4.5363g磷酸二氢钾（KH2PO4），用水溶解并定容至500ml。取上述1/15M磷酸氢二钠溶液85ml

9、和1/15M磷酸二氢钾溶液15ml混匀即可。3）没食子酸丙酯溶液：准确称取0.0500g没食子酸丙酯，用蒸馏水溶解移入50mL的容量瓶中稀释至刻度，摇匀。此溶液为lmg/ml。4操作方法1） 试样制备：称取用三种不同的提取方法得到的茶多酚产品各0.1000g，用甲醇溶解并定容至100ml。溶液浓度为0.1%。称取新买绿茶1g，用100沸水浴煮提两遍，得到的提取液定容至100ml。2） 测定步骤标准准曲线的制作分别吸取0, 0.25, 0.50, 0.75,1.00,1.25mL的没食子酸丙酯标准液于一系列25mL的容量瓶中，加入4mL蒸馏水，再加入酒石酸亚铁溶液5mL，用配制好的pH为7.5的

10、磷酸缓冲溶液冲稀至刻度，摇匀。用分光光度计，在540nm处，用lcm比色皿，试剂空白作参比，测量吸光度，测得结果绘制校准曲线，含量0-1250g/25mL符合比耳定律，回归方程为y = 相关系数为 。样品测定精确称取50mg左右的样品于小烧杯中，加蒸馏水溶解，并移入至50mL的容量瓶中，摇匀。吸取1mL样品液于25mL的小容量瓶中，加入4mL蒸馏水，摇匀。准确加入5.OmL的酒石酸亚铁溶液，摇匀。用配制好的pH为7.5磷酸缓冲液稀释至刻度，摇匀。用分光光度计，在540nm处，用lcm比色皿，试剂空白作参比，测量吸光度，由回归方程计算样品含量。5结果计算计算方法和公式：2.1.4茶叶饮料中EGC

11、G的反相高效液相色谱定量测定2.1.4.1实验部分(1)仪器及试剂 仪器: 岛津LC-20A型高效液相色谱系统：包括LC-20A型高压恒流泵、SPD-20A检测器和LC Solution工作站；超声清洗机；石英重蒸馏器。试剂：EGCG对照品( );甲醇(为色谱纯、J&K Chemical Ltd);冰醋酸(AR级);乙酸乙酯(AR级);重蒸馏水;试剂配制后分别用0.45m HA和0.5m FH薄膜过滤.(2) RP-HPLC条件 色谱柱: Inertsil C18（4.6mm250mm，5m）；流动相:甲醇-水-冰醋酸(18：60：0.2,体积比; pH6.26.5)；使用前用0.5m FH薄

12、膜过滤；脱气1520 min；选280 nm为检测波长；流速1.0 mL/min;室温。(3)标准贮备液的制备 精密称取在P2O5干燥器中干燥至恒重的EGCG对照品适量,用甲醇定容至一定体积使其成浓度为12mg/mL的标准贮备液。(4)样液的制备及测定 取样品(市售,北京科力福柠檬茶) 用甲醇定容至一定体积。2.1.4.2结果与讨论(1) EGCG对照品甲醇溶液及样品甲醇溶液的RP-HPLC谱图如图1。(2)方法线性关系 分别于0.50 mL甲醇中加入2、4、6、8、10L EGCG标准贮备液(12mg/mL)配成标准系列,每一浓度进样20L进行色谱测定。EGCG在26.8129.0 ng,以

13、HPLC色谱峰面积A与该峰代表的EGCG量X进行线性回归,所得回归方程为:A= (r= )。(3)方法回收率及重现性 分别于6份50 mL相同出厂批次的样品中精密加入EGCG标准溶液一定量,照样品处理及样液测定项下的方法用甲醇进行色谱测定,所测得的峰面积代入随行作的标准曲线方程中,求出测定值.该批样品含EGCG经三次测定的平均值为 ng/mL;每毫升萃取液中加入EGCG标准品的量为25.00 ng,测得相对回收率见表1. 同时连续6次精密进样5L EGCG标准溶液所测得峰面积的变异系数为2.12%,可见本色谱定量方法的重现性较好.(4)流动相中的冰醋酸作为离子抑制剂,可改善儿茶素化合物在HPL

14、C谱图中的峰形,但比例不宜过大,以防EGCG水解。2.2咖啡碱的定性、定量检测2.2.1咖啡碱的薄层定性检测硅胶薄板制作按1：3的比例称取硅胶GF-254和0.5%的CMC-NA，研磨约30min后，平铺到1020cm的洗净烘干的玻璃平板上，铺匀，隔夜，自然晾干。展开剂配制按甲苯：丙酮=6：4的比例配置（约需80ml）层析活化薄板：10530min。点样：所用液体为留取的待测液，点样量为25 uL。饱和：在层析缸内扣放入一培养皿，再将薄板放在上面,板子不接触层析液，在其蒸汽中饱和30min以上。层析：将板子放入展开剂中展开，待展开剂前沿距板子上端1.5cm取出，放入通风厨晾干。结果观察及分析:

15、（紫外灯下观察）2.2.2 HPLC法定量测定咖啡碱含量2.2.2.1实验材料及仪器甲醇(分析纯) 、双蒸水、微量进样器、咖啡碱标准品、样品、WATERS-2487高效液相色谱扫描仪、岛津高效液相色谱扫描仪2.2.2.1实验条件色谱柱：Symmetry C18(5m,4.6*150mm)流动相：甲醇:水=40：60流速：1ml/min检测波长：274nm（根据中华人民共和国国家标准 GB 8312-87 Tea- Determination of caffeine content 本标准适用于茶叶中咖啡碱的测定。在茶叶水浸出物中除去叶蛋白、茶多酚等物质后,留下的生物碱其测定波长为274nm者,

16、均称茶叶咖啡碱。）进样量：10l温度：室温2.2.2.3实验方法1标准溶液的配制准确称取咖啡碱标准品0.050g（纯度85%）,溶解定容于50ml有棕色容量瓶中,此液为0.85 mg/ml的咖啡碱标准溶液。2 待测样品的制备准确称取0.050g咖啡碱样品于50ml 容量瓶中,加水40ml 左右,摇匀,放入100 的烘箱内保温加热1h ,冷却后用水定容至刻度得样品待测液。3 样品的测定在上述液相色谱条件下,待仪器基线稳定后,按照标准溶液、待测样品溶液的顺序进样进行色谱分析。待测样品中咖啡碱浓度按下列公式计算:A标/A样=C标/C样式中:A为标准品中或待测样品中咖啡碱的峰面积值;C为标准品或样品中

17、咖啡碱的浓度（mg/ml）; 2.2.2.4实验结果检测图谱如下：2.2.2.5分析讨论2.3大孔树脂吸附实验2.3.1 大孔树脂静态吸附实验表1吸附树脂的物理性能型号极性比表面积/(m2/g) 孔径/nmLXX2.3.1.1树脂的处理和再生： 将树脂放入自来水中，溶胀后浮选，用1moL/L的NaOH溶液浸泡4h，用蒸馏水洗至中性，然后用0.5moL/L的HCl溶液浸泡3h，用蒸馏水洗至中性待用。树脂简单再生可用含量为95%的乙醇洗至无色，用蒸馏水洗至无白色混浊，并且无醇味，即可使用。当树脂反复使用后，吸附能力下降或受污染时需强化再生，可用酸碱处理再生后使用。2.3.1.2茶叶上柱液制备1）称

18、取50g绿茶茶叶，粉碎至粉末状，加入500ml 80自来水置80温箱中提取1.5h。2）用4层纱布趁热过滤，滤渣再加入400ml 80自来水置80温箱中提取1.5h。3）用4层纱布趁热过滤，滤渣再加入400ml 80自来水置80温箱中提取1.5h。4）用4层纱布趁热过滤，弃去滤渣，合并滤液，放置过夜，次日离心得上清液，总体积为 ml，留10ml用于检测。测定茶多酚浓度为原料茶多酚含量2.3.1.3 树脂饱和吸附量和脱附率的测定准确称取经预处理的用滤纸吸干表面水分的树脂1.00 g于100 ml三角瓶中，精密加入 mg/ml的茶叶上样液20.0 ml，在25，120 r/min的条件下振荡吸附1

19、8-24 h，过滤，树脂用蒸馏水冲洗3遍，一并合入滤液中，用蒸馏水定容至50ml。测定吸附后溶液中茶多酚的量，并按下式计算树脂的饱和吸附量。静态饱和吸附量(mg/g)= 加入的茶多酚量-未吸附的茶多酚量将上述经过18-24 h静态吸附茶多酚的树脂分离出来，吸干表面水分，然后用75%的乙醇25.0 ml，在25，120 r/min的条件下振荡脱附2 h，过滤，树脂用蒸馏水冲洗3遍，一并合入滤液中，用蒸馏水定容至50ml，测定脱附液中茶多酚的量，按下式计算脱附率。脱附率(%)=洗脱出的茶多酚量/(加入的茶多酚量-未吸附的茶多酚量)100%。不同树脂对茶多酚的吸附量和脱附率实验结果见表1 。表1 大

20、孔树脂静态吸附及解吸性能型号原液茶多酚量剩余液茶多酚量吸附茶多酚量/(mg/g)酒精洗脱茶多酚量脱附率/% LXX-175%/50mlOD 0.244191.004mg/20mlOD 0.591115.659mg/50ml75.345OD 0.43384.738mg90.21LXX-275%/50mlLXX-1215%/50ml原液茶多酚浓度：0.2441.957210=9.5502mg/ml；原料茶多酚含量：0.2441.9572103550ml1000100g100%=16.522%20ml原液茶多酚量：0.2441.95721020=191.004mg；剩余液茶多酚量：0.5911.95

21、7250ml=115.659mg洗脱茶多酚量：0.4331.957250ml=84.738mg附：咖啡碱树脂饱和吸附量和脱附率的测定标准品11.00mg/25ml = 0.44 mg/ml C18柱 流动相 甲醇：水 = 40 ：60 流速 0.7ml/min 波长 274nm 进样 20l附表1 咖啡碱含量测定出峰时间峰面积平均峰面积浓度（mg/ml）液体量/原料量含量（%）标准品9.36740755830.39.34140477751.440616790.90.44 茶母液(0523)9.55810963319.49.55910459763.210711541.31.16043550ml/

22、200g2.0604静吸附剩9.76535056393.99.68635580447.935318420.90.382650ml/1.127g1.697475%酒精洗9.5683284810.78.5883246800.73265805.70.0353850ml/1.127g0.15708静吸附剩9.74034934652.29.63834154479.734544566.00.374250ml/1.127g1.660注3550ml:20ml=200g：X，X =1.127g；附表2 大孔树脂静态吸附及解吸性能型号原液咖啡碱量剩余液咖啡碱量吸附咖啡碱量/(mg/g)酒精洗脱咖啡碱量脱附率/% LX8-423.208mg/20ml19.130mg/50ml 4.0781.769mg/50ml（75%）43.38LX8-823.208mg/20ml18.710mg/50ml4.4983.063mg/50ml（30%）68.10LX8-823.208mg/20ml18.710mg/50ml4.4980.000mg/50ml（75%）0.000LX8-1223.208mg/20ml19.225mg/50ml3.9831.601mg/50ml（15%）40.20LX8-1223.208mg/20ml19.225mg/50ml3.9830.000mg/50ml（75%）0.000结果分析：