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1、氢化可的松对创伤失血性休克后小肠血管内皮糖萼的保护作用【摘要】目的糖萼作为血管内皮的保护层;具有维持其通透性的作用，本研究期望证实创伤失血性休克能够导致肠道微循环内皮糖萼层的破坏，同时氢化可的松具有糖萼及肠道微循环的保护作用。方法本研究以大鼠创伤失血性休克模型为基础，采用激光多普勒血流检测法观察小肠血流灌注，通过电镜直接观察及肠系膜上静脉内硫酸乙酰肝素（heparan sulfate）和多配体聚糖-1（syndecan-1）质量浓度检测评估内皮糖萼的破坏程度，分别采用ELISA及Western-blot法检测肠系膜上静脉TNF-α质量浓度及小肠内皮细胞NF-κB的表达，
2、以探讨可能参与的分子机制，同时以氢化可的松治疗作为对照，评估其对创伤休克后小肠微循环功能的保护作用。结果大鼠在发生休克后早期（3h）即已出现肠道血流灌注显著下降（P【1】。近年来的研究表明血管内皮糖萼的完整性对微循环功能具有重要的意义。糖萼是衬于血管内皮细胞管腔膜侧的一层绒毛状细胞结构，由内皮细胞合成并分泌的众多分子组成，其中蛋白聚糖作为糖萼的主要骨架蛋白可维持其与内皮细胞的联系。糖萼作为心血管系统的重要屏障，具有维持血管通透性【2】、抑制细胞间黏附【3】等作用。Marechal等【4】在研究中观察了大鼠小肠肌层毛细血管内皮细胞糖萼因对不同相对分子质量的右旋糖酐具有不同的透过性而发挥分子筛的作
3、用，进而影响血管的通透性。更为深入的研究发现内皮所接触的血浆成分中TNF-α浓度过高可能是导致糖萼层降解的直接因素【5】，而Chappell等【6】则发现氢化可的松对缺血-再灌注损伤后血管内皮糖萼层具有保护作用，这一发现为糖皮质激素维护微循环稳定的诸多机制又增加了一种重要的可能。 本研究将以糖萼作为突破点，分析其结构损伤在T/HS早期肠道微循环障碍发生中的意义以及以氢化可的松为代表的糖皮质激素是否具有保护糖萼进而维护微循环稳定的作用，同时本研究将关注肠系膜上静脉（superior mesenteric vein，SMV）血TNF-α的质量浓度及其合成的因素，进一步探讨氢
4、化可的松对T/HS后肠道血管内皮糖萼及微循环功能保护的分子学机制。1材料与方法1.1实验动物 810周龄雄性SD大鼠，体质量200250g。购自浙江大学医学院动物研究中心。1.2创伤失血性休克模型建立 通过腹腔内注射1%戊巴比妥（0.4mL/100g）实施麻醉。分别对右侧颈静脉、颈动脉及左侧股动脉置管以备输液和测压及放血。钝性离断左侧股骨后经左股动脉快速放血（距模型开始20min）直到MAP降至（30±5）mmHg（1mmHg=0.133kPa），维持90min。对T/HS大鼠以2倍失血量的林格液（Ringers，RS）进行匀速复苏（10min）。最后拔除血管置管，缝合切口。1.
5、3动物分组及标本留取 对120只SD大鼠进行随机（随机数字法）分组：假手术组（SHAM，n=30），仅行麻醉及血管置管，不予创伤、放血及液体复苏;假手术治疗组（SHAM+H，n=30），假手术大鼠给予氢化可的松（H5885，sigma）治疗，以30g/kg的剂量溶于复苏液体中匀速进入大鼠颈静脉;创伤休克组（T/HS，n=30），进行完整的断股骨创伤、快速放血及液体复苏处理;创伤休克治疗组（T/HS+H，n=30），创伤休克大鼠在液体复苏时给予氢化可的松治疗。每组大鼠根据不同的检测及取材距离实验开始时间40、60、120、180、360min分为5个小组（n=6）。分别留取每组大鼠外周血及肠系膜
6、静脉血进行硫酸乙酰肝素，多配体聚糖-1及TNF-α检测;各时间点行平均动脉压（meanarterialpressure，MAP）及肠道肌层血流（bloodflowintheintestinelaminamuscularis，BFI）监测;留取液体复苏后360min小组大鼠小肠进行电镜下糖萼直接观察及NF-κB免疫组化检测。1.4血流动力学监测研究大鼠T/HS模型是否诱发了循环及小肠微循环动力学的改变，采用鼠尾袖带测压系统（tail-cuffsystem，BP-98A;Softron，Tokyo，Japan）监测平均动脉压;并采用激光多普勒仪（MoorInstrument
7、s，Axminister，England）在各时间点组大鼠取材前麻醉状态下剖腹后监测肠道肌层微循环血流。1.5小肠微循环内皮糖萼层破坏的监测 多配体聚糖-1及硫酸乙酰肝素作为糖萼的主要骨架蛋白可维持其与内皮细胞的联系。每组大鼠的外周血及肠系膜上静脉血均被收集，并采用ELISA分别进行多配体聚糖-1（HumanCD138/SYNDECAN-1ELISAKit，diaclone）、硫酸乙酰肝素（HeparanSulfateELISAKit，日本生化工业株式会社）的检测，具体方法参照各ELISA试剂盒说明书。 电镜观察被用作小肠血管内皮糖萼层的直接观察手段。小肠标本按照Vogel等和Rehm等的方法
8、处理后采用透射电镜（H-7650，HitachiHigh-Tech，Tokyo，Japan）观察。每个标本任取10处微血管内皮糖萼层进行厚度测量，并取平均值进行各组间的对照分析。1.6小肠微循环内皮糖萼层破坏的机制研究 采用免疫组化的方法检测小肠微循环内皮细胞phospho-p65NF-κB的表达。选取10μm厚的小肠石蜡切片脱蜡至水，0.3g/LH2O2甲醇溶剂室温作用30min，滴加山羊封闭血清1h后分别滴加鼠抗p-p65NF-κB抗体（CellSignalingTechnology，Beverly，MA）一抗371h，加生物素化山羊抗兔IgG二抗3720mi
9、n，DAKO法染色，DAB显色，苏木精-伊红复染，脱水，透明封片后光镜下观察（OlympusIPP6.0;Tokyo，Japan）。高倍镜下（x40），每张切片观察10个非重复视野，结合染色强度（03分分别代表染色强度由低到高）及阳性细胞比例（04分分别代表0%70%以上的阳性细胞比例）两项评分作为半定量评估方法，所有切片均由两名实验员进行双盲评分。 每组大鼠的外周血及肠系膜上静脉血均被收集，并采用ELISA法检测TNF-α（QuantikineELISAKit，R&DSystems，Minneapolis，USA）的变化，具体方法参照ELISA试剂盒说明书。1.7统计学方
10、法 计量资料以均数±标准差（x±s）表示，各组间采用ANOVA及Tukeystest的检验方法通过SPSS16.0软件进行分析。以P和白细胞黏附、迁移。中性粒细胞/内皮细胞黏附可产生足够的O2-和细胞毒性酶（弹力蛋白酶和胶原酶等），继续损害或摧毁实质和内皮细胞，并形成恶性循环，最终导致组织不可逆的病理改变。而小肠的灌注剧烈下降往往与心排血量下降不成比例，同时恢复灌注又远迟于全身。本研究发现，T/HS诱导了大鼠小肠出现显著的不能用平均动脉压变化来解释的灌注下降。3.2内皮细胞糖萼的破坏T/HS继发微循环障碍的主要原因 糖萼是衬于血管内皮细胞管腔膜侧的一层绒毛状细胞结构
11、，由内皮细胞合成并分泌的众多分子组成，其中蛋白聚糖作为糖萼的主要骨架蛋白可维持其与内皮细胞的联系，其成分包括：硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、透明质烷及硫酸角质素，降解其中的一些成分可导致糖萼降解。Chappell等【6】等发现在冠脉缺血-再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，I/R）等疾病过程中或外源性物质（透明质酸酶等）刺激下，糖萼的结构受到破坏，毛细血管壁的通透性增加，间质水肿;同时血管内皮细胞暴露，诱导白细胞与其黏附，进一步加重炎症爆发及血管内皮的损伤。Marechal等【4】在研究中观察了大鼠小肠肌层毛细血管内皮细胞糖萼对荧光标记的不同相对分子质量的右旋糖酐的
12、通透情况，发现较大的分子（150000）不能透过糖萼，而较小的分子（4000）容易透过糖萼，提示糖萼可以发挥分子筛的作用，影响血管的通透性。而小肠在发生缺血-再灌注过程后较大分子右旋糖苷亦能通过糖萼。 本研究通过电镜及SMV血中糖萼成分等检测发现T/HS发生早期小肠黏膜下毛细血管内皮糖萼的结构即出现了明显的破坏，同时笔者发现SMV血中的糖萼的主要成分硫酸乙酰肝素和多配体聚糖-1的质量浓度明显升高，从而进一步证实了上述表现。3.3内皮细胞糖萼破坏的可能机制 新近的研究发现内皮糖萼的破坏可能与机体在遭受感染性休克等应急状态下分泌过多肿瘤坏死因子α（TNF-α）有关。Henr
13、y和Duling【5】利用岩藻依聚糖阻断中性粒细胞与内皮细胞的黏附后TNF-α仍旧能够诱导糖萼的损伤，初步证实TNF-α可能通过中性粒细胞非依赖方式直接作用于内皮细胞，后者释放氧自由基、蛋白激酶、磷脂酶造成糖萼损伤。Chappell等的研究发现使用抗凝血酶能够通过改善内皮细胞的炎症反应、缓解TNF-α所诱导的糖萼破坏，进一步证实了血管内皮细胞本身的炎症状态，尤其是在TNF-α作用下所形成的局部炎症反应体系是决定糖萼结构完整性的重要因素。创伤失血性休克又是如何诱导内皮细胞产生TNF-α的？细胞表面Toll样受体4（toll-like r
14、eceptor4，TLR4）和跨膜蛋白髓样分化蛋白88（myeloid differentiation protein 88，MyD88）及其下游的p38有丝分裂原激活蛋白激酶（p38mitogen-activated protein kinase，p38-MAPK）、核转录因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）作为一种经典的信号传导通路在创伤和休克发生后的迅速激活对TNF-α合成表达起到了重要的调控作用。本研究发现T/HS大鼠小肠毛细血管内皮细胞浆内NF-κB表达明显增高;另一方面T/HS大鼠SMV血中TNF-&
15、alpha;的质量浓度较外周血更高、维持的时间更长，说明创伤休克后肠道来源（汇入SMV）的TNF-α可能是其全身总量升高的主要贡献者之一，同时小肠内皮细胞NF-κB的高表达可能成为其TNF-α合成增加以及糖萼破坏的主要机制。由此笔者进一步推测肠道作为T/HS病理生理状态中最易受损的器官，不仅出现了严重的微循环等衰竭，同时亦可能成为全身炎症爆发的主要贡献者，这还需要进一步的研究来证实。3.4糖皮质激素对小肠血管内皮糖萼的保护作用 氢化可的松长期以来被临床用于防治继发于缺血-再灌注损伤后毛细血管渗漏综合征及组织水肿，其可能的机制与其抑制由多种炎症介质及细胞因子介
16、导的炎症细胞浸润的作用有关;此外氢化可的松亦具有稳定细胞膜及细胞器膜尤其是溶酶体膜的作用，能减少溶酶体酶的释放及降低血管活性物质、组胺、缓激肽、儿茶酚胺的质量浓度、抑制白细胞产生氧自由基，而溶酶体酶、血管活性物质、氧自由基的释放增多均与肠缺血及再灌注损伤的病理相关，造成组织损伤及血管通透性增加。Chappell等【6】的研究开创性地发现了氢化可的松能够有效地保护内皮糖萼结构的稳定性并有效改善缺血-再灌注损伤后组织水肿的程度。本研究在更为接近于真实情况的创伤休克模型上证实氢化可的松能够较为明显地减少小肠微循环内皮细胞NF-κB的表达及SMV血中TNF-α的质量浓度，减少糖
17、萼的分解及损伤并恢复肠道微循环的血流。这与有关糖皮质激素具有通过抑制NF-kB的活性来阻遏TNF-α的表达的作用的研究结果是相辅相成的。由此笔者初步判断氢化可的松能够较为有效地保护小肠内皮糖萼的完整性及微循环的功能进而改善全身的炎症状态，其作用机制可能与抑制TNF-α的合成及其相关的信号通路有关。但是糖皮质激素是否能在创伤休克发生后具有保护肠道屏障功能，是否抑制细菌移位及脓毒血症的发生，尚需进一步的研究证实。综上所述，糖萼的破坏可能参与了创伤失血性休克后小肠微循环障碍及屏障功能损伤的机制，内皮细胞NF-κB表达活化及TNF-α的大量合成可能参与了
18、糖萼破坏的分子学机制。以内皮细胞糖萼作为治疗靶点，氢化可的松可能具有较好的疗效。参考文献【1】Hotchkiss RS， Karl IE. The pathophysiology and treatment of sepsis. N Engl J Med，2003，348（2）：138-150.【2】Cabrales P， Vázquez BY， Tsai AG， et al. Microvascular and capillary perfusion following glycocalyx degradation. J Appl Physiol，2007，102（6）：225
19、1-2259.【3】Chappell D， Dorfler N， Jacob M， et al. Glycocalyx protection redu-ces leukocyte adhesion after ischemia/reperfusion. Shock，2010， 34（2）：133-139.【4】Marechal X， Favory R， Joulin O， et al. Endothelial glycocalyx damage during endotoxemia coincides with microcirculatory dysfunction and vascular oxidative stress. Shock，2008， 29（5）：572-576.