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1、拟穴青蟹阳离子非依赖6- 磷酸甘露糖受体（SpCI-MPR）基因的克隆和功能研究阳离子非依赖 6- 磷酸甘露糖受体 (cation-independentmannose-6-phosphate receptor,CI-MPR)又称胰岛素样生长因子II受体(Insulin-like growth factor-II receptor,IGF2R),隶属于 P 型凝结素家族 ,是一种多能细胞受体。然而, 过去对 CI-MPR的研究主要局限于脊椎动物, 在甲壳动物中尚没有相关的研究报道。拟穴青蟹 (Scylla paramamosain)是一种典型的甲壳动物 , 广泛分布于我国的东南沿海等地。近年来
2、, 对拟穴青蟹的研究已取得了一定成果。拟穴青蟹良好的研究背景为研究CI-MPR基因的功能奠定了基础。本研究以拟穴青蟹 CI-MPR(以下称 Sp CI-MPR)基因为研究对象 , 主要研究内容和结果如下 :1. 获得拟穴青蟹 CI-MPR基因的全长序列本研究在已知部分序列的基础上 , 利用 RACE方法获得了拟穴青蟹 Sp CI-MPR基因的 c DNA 全长序列 , 序列已上传至Gen Bank(Accession number:KM658157) 。该序列长度为 3931 bp, 编码 1095 个氨基酸。序列分析显示该基因编码的蛋白含有 7 个保守的“ MRH”结构域 , 每个结构域均含
3、有保守的6-8 个半胱氨酸 , 该结构为 CI-MPR蛋白的特异保守结构域。对氨基酸序列进行BLASTP在进行同源性检索发现Sp CI-MPR 蛋白序列与其它动物的 CI-MPR蛋白序列具有较高的同源性。 基于 CI-MPR蛋白氨基酸序列构建的系统进化树同物种进化关系保持一致。由此表明已成功克隆到拟穴青蟹Sp CI-MPR基因的 c DNA全长序列。 2. 生物信息学方法对 Sp CI-MPR基因进行功能和特征分析该蛋白存在大量的糖基化和磷酸化位点。在 Sp CI-MPR蛋白的 7 个结构域中 , 结构域 5 和结构域 6 同哺乳动物的结构域 3 和结构域 9 拥有较高的同源性 , 推测两个结
4、构域在磷酸甘露糖 (mannose6-phosphate,Man-6-P) 结合时发挥着重要的作用。同时, 基于结构比对的分析发现 ,Sp CI-MPR 蛋白缺少与 IGF-II结构位点相关的疏水基团和必须氨基酸, 由此推测拟穴青蟹的Sp CI-MPR蛋白不具有调控IGF-II的功能。3. 对 Sp CI-MPR基因进行时空表达分析为研究 Sp CI-MPR基因对拟穴青蟹生长和早期发育的影响 , 本文检测了其在拟穴青蟹从刚出生后的蚤状幼体 I 期(Zoea I,Z1)、蚤状幼体 II期(Zoea II,Z2)、蚤状幼体 III期 (Zoea III,Z3)、蚤状幼体 IV 期(Zoea IV,
5、Z4)、蚤状幼体 V 期(Zoea V,Z5) 和大眼幼体(Megalopae,M)Sp CI-MPR 基因表达量的变化。结果发现, 从胚胎到幼体出生后3天内其表达量无显著变化, 此后其表达量逐渐上升, 在 Z2 达到最高 , 然后逐渐下降并趋于平稳。同时 , 我们还检测了该基因在拟穴青蟹肌肉、血液、肝胰腺、胃、腮、睾丸、卵巢、心脏鳃、结缔组织、胸神经节和脑神经节这11 个组织中的表达分布情况。结果显示 Sp CI-MPR基因的表达量呈现一定的组织特异性, 在肝胰腺、血液和心脏这 3 个组织中的表达量最高 , 在其他组织中的表达量较低。上述结果暗示 Sp CI-MPR基因可能在拟穴青蟹的生长发
6、育起着重要的作用。4. 拟穴青蟹中 Sp CI-MPR 基因的印迹表达模式以及与其表达量之间的关系对SpCI-MPR基因的序列分析发现在5端含有大量的 Cp G岛序列 , 为潜在的甲基化位点 , 提示该基因可能为印迹基因。对杂合子等位基因的转录情况分析表明Sp CI-MPR基因为印迹基因。 组织水平的分析提示 Sp CI-MPR 基因在拟穴青蟹中印迹表达模式具有组织特异性。同时结果显示 Sp CI-MPR基因在正常非印迹组织中的表达量明显高于印迹组织中的表达量 ,Sp CI-MPR基因的印迹状态与其表达水平之间具有一定的相关性。印迹调控通过改变有效转录基因的拷贝数来进行调控表达对基因的表达量进行调控 , 从而影响生长和发育等过程。5. 载体构建了原核表达载体 , 获得重组蛋白此外 , 我们利用 p ET-30a(+) 载体构建了原核表达载体 , 并在大肠杆菌 (Escherichia coli)BL21(DE3)菌株中表达得到了 130.5 k Da的融合蛋白 , 同时我们优化了重组融合蛋白表达的最佳条件。SDS-PAGE和 Western-Blotting鉴定结果均表明已成功获得了重组融合蛋白。重组蛋白的成功表达为今后深入研究Sp CI-MPR基因的功能提供了研究材料。