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1、翼齿六棱菊5 -olide分离纯化及生物学活性评价天然抗肿瘤药物是抗癌药物的一个重要分支, 在临床抗癌治疗中占有极其重要的地位。本研究选择具有清热消炎止咳作用, 以及抗肿瘤潜力的中药翼齿六棱菊为研究对象 , 分离纯化所含的小分子化合物, 从中筛选具有促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长活性的物质, 并探讨其体外抗肿瘤作用的活性, 为寻找高效、靶标独特的抗肿瘤新药提供研究基础。取得了以下结果。 1、应用硅胶、凝胶、高效液相等多种色谱分离技术, 从翼齿六棱菊中分离到7 个候选化合物 , 包括 4 个黄酮和 3 个倍半萜 ; 经 NMR,MS等方法检测 , 分别鉴定为 5 -olide、Isocost
2、ic acid、3H-Naphth1,8a-boxirene-7-acetic acid、 Artemetin 、 3,6,7,4 -Tetra-O-methyl-5,3-dihydroxyflavone、 5-hydroxy-2-（ 4-hydroxy-3-methoxyphenyl ）-3,6,7-trimethoxy-4H-chromen-4-one、4,5-Dihydroxyflavone。2、采用 MTT（3- （ 4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide）法评价翼齿六棱菊中分离到的上述7 个化合物的
3、体外抗肿瘤活性, 浓度 40M时抑制率分别为 90%、11.3%、4%、9.7%、16.1%、0%、2.9%, 结果表明 5-olide抑癌活性最好。3、采用 MTT法将 5 -olide对 SMMC 7721、SW480、 MDA-MB-231、 T47D和 Hela 这 5 株肿瘤细胞进行IC50 测定 , 其 IC50 分别为 3.36mM/L、 4.04mM/L、11.8mM/L、10.57mM/L、14.31mM/L。4、通过检测 5 -olide处理后 SMMC7721、SW480的生长曲线 , 发现 5 -olide浓度 2mM,处理 24h, 开始出现细胞增殖的抑制活性。5、应
4、用荧光显微镜观察SMMC 7721细胞核形态的变化 ;8mM的 5-olide处理 SMMC 7721细胞 24 h, 细胞核发生了明显的畸形变化, 一些细胞核呈月牙型且皱缩边集化, 具有典型的凋亡形态。采用 Hoechst/PI （ Propidium Iodide ）染色后发现 , 随着 5-olide浓度的加大和作用时间的延长 , 亮蓝色的细胞增多 , 表明细胞凋亡增加。 6、应用 DCFH-DA（ 2 ,7 -Dichlorodihydrofluorescein diacetate）方法检测 5-olide对SMMC7721内源活性氧的影响 ; 通过 ROS（reactiveoxyge
5、n species ）清除试验检测细胞凋亡是否与ROS有关 ; 结果表明 ,H2O2组及 8mM5 -olide处理组诱导明亮的绿色荧光产生, 说明此时 ROS大量生成 ; 当加入 NAC（ N-acetyl-L-cysteine）清除 ROS之后 ,5 -olide对 SMMC7721 的细胞毒性显著降低 , 说明 5 -olide是通过触发 ROS过度产生引起 SMMC7721凋亡。7、通过检测 JC-1（5,5 ,6,6 -Tetrachloro-1,1,3,3 -tetraethylimidacarbocyanine iodide）, 观察 5-olide对 SMMC 7721线粒体膜
6、电位的影响 ; 使用 Mito-tracker Red探针标记细胞线粒体后 , 在激光共聚焦下观察5-olide对细胞线粒体形态的影响; 研究发现 :Control组细胞红色荧光较强 ,FCCP组绿光较强 , 随着 5-olide的浓度增加 , 绿色荧光逐渐增强 ,8mM时绿色荧光较强 ; 用 Mito-tracker Red染料染色 , 可发现 5-olide处理后的细胞线粒体呈颗粒状 , 说明 5-olide能降低线粒体膜电位 , 使线粒体破碎。 8、Western blot方法 , 观察 5-olide处理 SMMC 7721前后细胞线粒体凋亡通路相关蛋白的变化;发现 5-olide处理
7、组 Bax、Bid 上调 ,Bcl-2下调 ,caspase 3和 PARP上调。9、采用克隆形成试验、 细胞划痕及 transwell试验 , 检测 5-olide对 SMMC7721 细胞生理性能的影响。 5-olide处理细胞 24 h 后, 随着 5-olide浓度升高 , 单克隆形成的集落越少 ; 细胞划痕愈合减少 , 愈合能力逐渐减弱 ,transwell细胞迁移到下室的数量也减少。结论 : 从翼齿六棱菊中分离到7 个化合物 , 其中 5-olide抗肿瘤活性最好 ,并且可以抑制多种肿瘤细胞的增殖, 对 SMMC 7721抑制最强。 5-olide能引起7721 细胞凋亡并使 ROS过度产生 , 使线粒体膜电位降低 , 线粒体促凋亡蛋白Bax、Bid 上调 , 抑凋亡蛋白 Bcl-2 下调 , 最终导致激活 caspases 启动细胞凋亡的级联反应。因此本研究首次揭示了化合物5-olide可以通过线粒体 caspases 途径引起 7721 细胞凋亡且也是 ROS依赖的凋亡。 5-olide能抑制细胞克隆的形成 , 细胞迁移。本研究为开发新型抗肿瘤药物提供了基础研究。