人工种子与植物脱毒详解课件.ppt

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1、1,第4章 人工种子与植物脱毒,人工种子的概念和研制的意义 人工种子技术 离体繁殖体培养 人工种子的包埋技术 人工种子的贮藏 人工种子的应用前景,2,人工种子（Artificial seeds）,任何一种经人工种皮包被或裸露的，具有形成完整植株能力的繁殖体均可称之为人工种子。 胚状体或不定芽 人工种子亦称体细胞种子(somatic seeds)，又称合成种子（synthetic seeds） 。,3,人工种子的种类 根据包被的程度可将人工种子分为三大类：,裸露的或休眠的繁殖体,人工种皮包被的繁殖体,水凝胶包被的繁殖体,4,人工种子的研究状况,1978年，英国Murashige首先提出人工种子。

2、欧洲列入尤里卡计划、日本和美国列入优先发展生物技术计划。我国1987年将其列入国家高技术研究与发展计划。据报道，目前已对26个科，36个属的植物进行了人工种子研究。其研究范围显示出两大特点：,经济作物和粮食作物的人工种子日益增多 以微器官作为繁殖体的报道日益增多，其中包括微芽、微枝、原球茎、小鳞茎、小块茎。,5,以器官为繁殖体的人工种子,6,以体细胞胚为繁殖体的人工种子,7,人工种子研制的意义,人工种子结构完整，体积小，便于贮藏与运输，可直接播种，易于机械化操作； 不受季节限制，不受环境制约，胚状体数量多，繁殖快、有利于工厂化生产； 有利于繁殖生育周期长、自交不亲和、珍贵稀有的一些植物，也可大

3、量繁殖无病毒材料; 可在人工种子中加入抗生素、菌肥、农药等成分，提高种子活力； 体细胞胚由无性繁殖体系产生，可以固定杂种优势。,8,繁殖体的培养技术,人工种子技术,9,人工种子对体细胞胚繁殖体的要求,作为人工种子繁殖体的体细胞胚，其基本要求是要具有发育上的同步性（如何诱导），还必需满足如下标准特征： 形态正常，具有完整的胚结构。 与母体植物的基因型基本相同，特别是在 重要经济性状和农艺性状上没有变异。 具有较好的成熟性，能耐一定程度的脱水。,10,其次，作为实用化的体细胞胚种子还必须满足一定的数量需求，规模化生产是其基本前提。 Choi等（2002）建立了人参体细胞胚大规模液体培养体系，每50

4、0ml容器可生产体细胞胚12,000个。在体细胞发育至子叶期早期，将期转入1/2MS无机盐加9蔗糖的培养基中诱导，获得了良好效果。,11,微型营养器官繁殖体的培养,温度 马铃薯18-20 光照 马铃薯短 培养基渗透压 马铃薯8蔗糖 激素 与内源激素水平变化和平衡有关,地黄根茎,半夏块茎,马铃薯块茎,12,芽繁殖体的培养,大多数情况下，微芽、不定芽的培养往往直接从外植体上直接诱导形成，培养方式简单，且勿需高浓度的激素处理，因此所产生的繁殖体基本保持了原有植物的品种特性。 根据植物类型不同，可选择不同的外植体作为芽发生的来源: 非洲紫罗兰一般选用叶片为外植体，诱导不定芽作为微繁殖体； 榆树类植物则

5、可选根作为外植体产生微芽； 石竹类花卉可以茎尖为外植体培养侧芽作为繁殖体,13,部分植物繁殖体诱导培养条件,LH，水解乳蛋白Ade，腺嘌呤,14,繁殖体的包埋,繁殖体的预处理 体细胞胚的后熟培养与脱水干燥 微型器官繁殖体适度脱水与表面消毒处理以及必要时的强制休眠处理,15,人工种皮,分内种皮和外种皮 对人工种皮的要求：具有保护胚的功能，并且无毒性、通气好、抗污染、抗压性好、不粘连、适于贮藏和运输。 内种皮：聚氧乙烯、海藻酸钠、明胶、琼脂等。,16,外种皮常用材料： Elvax 4260(乙烯、乙烯基乙酸和丙烯酸共聚物，1987，美国)涂膜，价高，操作复杂，效果不佳。 Tullanox和Cab-

6、0-sil(二氧化硅化合物），以粉末状包裹在人工种子胶囊外层，操作时只需将胶囊在材料中滚动即可。 硅酮种衣，能抗真菌，渗入水蒸汽和氧气，处于试验之中。,17,人工胚乳,成分：无机盐混合物、碳水化合物（糖和淀粉）、蛋白质。 糖分存在容易导致微生物感染而腐烂，所以人工胚乳中也要加入防腐剂、抗菌素、农药等。 人工胚乳添加的两条途径： 直接法 微型包裹法,18,包埋技术,干燥法 聚氧乙烯干燥法包埋是最早的人工种子包埋技术，即将胚状体置于23、相对湿度70%的黑暗条件下逐渐干燥，然后用聚氧乙烯包裹胚状体。 液胶包埋法 胚状体不经干燥包埋，直接与流体胶混合后播入土中。应用此法，胚成活率低，常因干燥而死亡。

7、,19,包埋技术,水凝胶法 是最常用的一种方法。即用海藻酸钠等水溶性凝胶经与钙离子进行离子交换后凝固，用于包埋单个胚状体。种子硬度由凝胶浓度与络合物离子交换时间决定。 CaCl2浓度：2.0%-2.5% 离子交换时间：20min-30min 无菌水漂洗20min,Flash,20,植物人工种子的成苗率,21,贮藏,贮藏条件：47低温、相对湿度小于67% 贮藏中存在的问题： 种胚质量不高、后期停止生长、胚腐烂、种子失水干缩等。 解决措施： 胚乳中添加防腐剂、抗生素、控制糖含量、低温贮藏，种皮外包裹滑石粉、液体石蜡等成分。,22,人工种子可能最先用于无性繁殖植物 微芽，试管块茎、鳞茎等作繁殖体时，

8、成苗率高且出苗整齐，具有田间应用的可行性，同时，离体培养的繁殖体可完全去除病原物。 传统上的试苗由于体积大、对携带储运条件要求苛刻因而限制了使用规模。如果利用人工种子将可能首先实现无性繁殖植物种子生产的彻底革命。 1. 以微芽为繁殖体的人工种子技术，有可能首先在无性繁殖的果树、花卉、林木等植物中得以应用。,人工种子的发展和应用前景,23,人工种子的发展和应用前景,2. 微器官人工种子可用于天然种子繁殖后代群体变异大的植物 有些植物如桉树，虽然能够用天然种子繁殖，但种子繁殖的植株变异大，树体不整齐。 微芽试管苗繁殖技术已在生产上显示了树体整齐的优越性，目前以微芽为繁殖体的人工种子技术已经建立。

9、桉树人工种子在土壤中的成苗率已可达80%以上，且树体十分整齐。,24,25,以体细胞胚为繁殖体应用的局限性及可能性 以花或果实为经济产品的多年生植物如果树有可能出现较长的幼年期，使开花结果推迟，且还可能出现果实不整齐的现象。 以营养器官或木材为产品的植物中，对性状一致性要求不严格的植物中，体细胞胚繁殖体具有其它繁殖体不可替代的优越性。,人工种子的发展和应用前景,26,人工种子的发展和应用前景,以体细胞胚为繁殖体应用的局限性及可能性 容易建立生产工艺，已经具备高质量的体细胞胚胎发生技术体系的植物，如苜蓿、胡萝卜等。 不具备或不完全具备高质量体细胞胚胎发生体系，商品价值较高，但许多种类育性不佳，繁

10、殖困难，或者生产杂种费用昂贵。 比较容易建立生产工艺，具备完善的胚胎发生技术体系，经济价值也很高。咖啡、玉米等。,27,存在问题,许多重要的植物目前还不能靠组织培养快速产生大量的、出苗整齐一致的、高质量的体细胞胚或不定芽。 包埋剂的选择及制作工艺方面尚需改进，以提高体胚到正常植株的转化率，并达到加工运输方便、防干防腐耐贮藏的目的。 如何进行大量制种和大田播种，实现机械化操作等方面配套技术尚需进一步研究。,28,小结,人工种子是在实验室人工控制条件下生产的繁殖体。 人工种子繁殖体包括体细胞胚、微型器官和微芽，根据植物种类不同可适当选择。 人工种子应用的基本条件是繁殖体的工厂化生产和配套技术的成熟

11、。 无性繁殖植物的人工种子有望最先得以应用。,29,思考题,人工种子的概念和类型。 人工种子对体细胞胚繁殖体有什么要求？ 目前人工种子生产中需要解决的主要技术问题。 目前人工种子最适于在哪些方面应用？,30,植物离体培养脱毒技术,病毒在植物体内的分布及危害 植物脱病毒方法 脱毒植物检测及保存,31,病毒的特性及其对植物的危害,大多数植物病毒不经种子传播； 无性繁殖的植物，都易受到一种或多种病毒的侵染。,32,33,郁金香杂色花,郁金香正常花,34,病毒在植物体内的分布,病毒在植物体内的分布具有不均匀性，随植株不同部位和年龄而异。 老叶和成熟组织及器官中病毒含量较高 根尖、茎尖生长点约0.11m

12、m区域内，几乎不含病毒。 （原因？） （原因：分生组织细胞分裂和生长速度快，而病毒在植物体细胞内繁殖速度相对较慢；另外，病毒是通过筛管组织或胞间联丝传播至其他组织细胞的，而茎尖分生组织无分化，没有维管组织。）,35,病毒在植物体内的分布具有不均匀性的理论假说 (1) 能量竞争 病毒核酸和植物细胞分裂时DNA合成均需要消耗大量的能量，而分生组织细胞本身很活跃，其DNA合成是自我提供能量自我复制，而病毒核酸的合成要靠植物提供能量来自我复制，因而就得不到足够的能量，从而就抑制了病毒核酸的复制。 (2) 传导抑制 病毒在植物体内的传播主要是通过维管束实现的，但在分生组织中，维管组织还不健全，从而抑制了

13、病毒向分生组织的传导。,36,(3) 激素抑制 在分生组织中，生长素和细胞分裂素水平均很高，因而阻滞了病毒的侵入或者抑制病毒的合成。 (4) 酶缺乏 1969年，Stace-Smith提出，可能病毒的合成需要的酶系统在分生组织中缺乏或还没建立，因而病毒无法在分生组织中复制。 (5) 抑制因子 1976年，Martin-Tanguy等提出了抑制因子假说，认为在分生组织中存在有某种抑制因子。,37,38,热处理脱毒法,原理 热处理不能杀死病毒，只能钝化病毒的活性，使病毒在植物体内增殖减缓或停止，而失去侵染能力； 作为一种物理效应可以加速植物细胞的分裂，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。,39,4

14、0,热处理脱毒法,愈伤组织热处理法 从患病植株上取叶片（茎片、鳞片、花器等）进行离体培养，诱导形成愈伤组织，然后将愈伤组织反复继代培养同时兼用热处理。 常用的温度及处理时间 37 38（2、4或8周） 50（315min),41,热空气处理脱毒法 将试验母株在高温生长室中生长一个阶段，使其顶端分生组织和次生分生组织迅速生长，然后切取其茎尖分生组织进行离体培养。 生长室温度（35 40） 光照强度（300010000Lx),42,愈伤组织继代兼热处理钝化TMV和CMV获得烟草无病毒植株的效果,结论: 病毒种类不同,愈伤组织反复继代兼热处理的效果不同；TMV、CMV均经37热处理，脱毒效果最好。,

15、43,其它效果 香石竹（康乃馨）在3840下经两个月处理可除去全部病毒。,44,马铃薯在37下处理1020天能除去卷叶病毒。,45,热处理脱毒法,优点 方法简单，效果明显。 缺点 具有局限性，不能去除所有病毒。只对圆形病毒（苹果花叶病毒），或对线状病毒（马铃薯卷叶病毒）有效；而对杆状病毒（千日红病毒）无效。 极易使植物材料受热枯死，造成损失,46,茎尖培养脱毒法,依据 原理,47,康乃馨不同大小茎尖与康乃馨斑驳病毒的脱毒效果,48,影响茎尖培养法脱除植物病毒的因素,母体材料病毒侵染的程度 外植体的生理状态 起始培养的茎尖大小,茎尖培养法脱除植物病毒的技术关键,茎尖越小对培养基的要求越高，成功率

16、越低。,49,微体嫁接法(micrografting),应用微体嫁接的原因： 木本植物茎尖培养难以生根形成植株。 具体做法： 将极小的茎尖（0.14mm1.0mm）作为接穗嫁接到不带病毒的种子实生苗砧木上，然后将砧木、接穗一起在培养基上培养。 优点： 接穗在砧木上易成活，故可用很小的茎尖来培养，去除病毒几率大，获得无病毒苗的可能性大。,50,苹果茎陷病毒的茎尖培养脱毒 接穗： 0.2mm茎尖 砧木：无菌实生苗的胚轴（带两片子叶） 方法：劈接法将接穗插入两片子叶之间的组织中,51,微体嫁接法(micrografting),脱除病毒的关键： 要求剥离技术很高 需要考虑砧木和接穗对营养组成的不同要求

17、； 与接穗的取材季节有密切关系（苹果46月取材嫁接成活率较高。）,52,珠心组织培养脱毒法,依据： 病毒通过维管组织传播，而珠心组织（孢子体部分）与维管组织没有直接联系，故可以通过珠心组织培养获得无病毒植株。 目前已用该方法去除了柑橘银屑病、叶脉突出病、柑橘裂皮病、速衰病等病毒。 该方法的缺点： 存在20%30%左右的变异率，无病毒苗苗期较长。柑橘要68年才能结果。,53,胚珠,54,55,愈伤组织培养脱毒法,通过植物器官或组织诱导产生愈伤组织，然后从愈伤组织再诱导分化芽，长成植株，可以获得脱毒苗，这在天竺葵、马铃薯、大蒜、草莓、枸杞等植物上已先后获得成功。利用诱导各器官愈伤组织培育无病毒苗的

18、机制，可能有如下几种： （a）病毒在植株体内不同器官或组织分布不均 （b）病毒复制能力衰退或丢失； （c）继代培养的愈伤组织抗性变异。,56,57,几种马铃薯病毒病的症状,58,血清鉴定法(serologic test),实验依据：沉淀反应 植物病毒“抗血清”在植物病毒诊断中优点： 病毒抗血清具有高度专化性： 专一性；“预见性”；定量性。 病毒抗血清在诊断上的局限性： 不是所有病毒都能制成抗血清 能够提纯的病毒量太少，或在提纯过程中丧失了必备的抗原结构； 植物体内的单宁物质使病毒丧失了抗原性质。,59,血清鉴定法,基本方法： 玻璃片凝集法 （平皿）微量凝集试验 试管沉淀反应 免疫双扩散 ELI

19、SA,病毒感染,人工注射异体蛋白,动物,动物,植物,带该种病毒,血清反应,+,免疫球蛋白,（抗原）,（抗体）,（抗原）,60,生物鉴定法（指示植物鉴定）,依据： 指示植物对病毒极为敏感，一旦感染病毒就会在叶片或全株上表现出特有的病斑。 指示植物： 对环境中的一个因素或各因素的综合条件具有指示作用的植物种 指示植物分类： 接种后产生的症状可扩散到非接种部位。 只在接种部位产生明显病斑。 优点： 操作方便，条件简单，经济有效；还可以根据病毒的寄生范围，确定几种指示植物，准确性强。,61,生物鉴定法,接种方法 摩擦接种法 取待检查植株叶片，经处理后用其汁液和金刚砂混合，轻轻摩擦指示植物叶片，使汁液能

20、侵入叶片表皮细胞但又后，观察指示植物有无病毒感染症状。,马铃薯X病毒侵染千日红（叶片呈枯斑） 马铃薯M病毒侵染千日红（叶片呈突起枯斑）,62,嫁接法 一些木本多年生果树或草莓等无性繁殖草本植物，其病毒不是通过汁液而是其他介体传播如草莓黄化病毒是由蚜虫（Mtzus fragaefolii）传播的，这种病毒鉴定可采用嫁接法，即用鉴定植株芽作接穗，指示植物作砧木。根据指示植物的表现判断是否脱除了病毒。,63,电镜检查法,直接观察，检查是否有病毒颗粒。 优点：准确，有效 不足：需要一定的设备和技术（超薄切片技术、背景染色法、扫描电镜使用）。,64,分子检测法,优点：快速、简便、灵敏度高和特异性强。 常用的方法 聚合酶链式反应（PCR） 双链RNA分析技术 核酸分子杂交和序列分析技术 RFLP、RAPD等分子标记技术,65,无病毒原种的保存与繁殖,无病毒原种的保存 可利用隔离法进行保存。 无病毒原种的繁殖 建立一套严格的良种繁育制度，生产场所做好土壤消毒和防昆虫工作，保持无病毒原种材料质量。,66,脱毒苗保存,67,思考题 1利用茎尖分生组织培养脱除去植物病毒的原理。 2哪些因素会影响茎尖培养的脱毒效果？ 3. 如何检测脱毒效果？ 4. 基本概念,