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1、光引发聚合改性明胶用于牙组织工程的方法观察论文组织工程化牙髓牙本质复合体常用的支架材料有羟磷灰石（ hydroxyapatite ，HA）- 磷酸三钙（tricalciumphosphate ，TcP）、纳米碳化硅（siliconcarbide ，sic ）增强 HA复合材料，明胶、胶原、甲壳素等，三维支架为新生组织提供了生长空间，支持细胞生长，增殖并模拟胞外基质的许多功能。 明胶被广泛用作生物医用材料， 但其凝胶性不耐久， 35以上即溶化为溶胶态。 如果利用明胶侧链基团反应活性高的性质， 将丙烯酸类单体接枝到明胶分子上， 就可在正常体温条件下长时间保持明胶的凝胶形态。甲基丙烯酸（ methy
2、lacrylicacid ，MA）改性后的明胶在紫外光和光引发剂共同作用下可生成水凝胶，是软骨组织工程研究中使用的一种支架材料，这种可注射光引发聚合水凝胶材料能够自我塑形， 用于填充形状和尺寸各异的组织缺损， 造成的创伤小， 能使得细胞均匀分布在支架材料内部呈三维立体生长， 提供仿生的环境， 水凝胶含有大量的水分可支持营养物质和细胞代谢产物的交换。因此本研究以人牙髓细胞（ humandentalpulpcell ，hDPC）为对象，研究光引发聚合甲基丙烯酸改性明胶（ gelatinmethacrylate ，GM）水凝胶是否有作为牙髓再生支架材料的潜能。1. 材料和方法1.1材料A型明胶（ a
3、cid-processedgelatin，G）、94%MA、艳固佳 2959型光引发剂（Sigma公司，美国），透析袋（Biosharp 公司，美国），a 型改良伊格尔培养基（modi-fiedeaglesmediumofalphatype，u-MEM）、改良杜氏伊格尔培养基（dulbeosmodifiedeaglemedium，DMEM）（Hyclon 公司，美国），胎牛血清（fatalbovineserum，FBS）（ Hyclon 公司，美国）；磷酸盐缓冲液（phosphatebuffersolution ，PBS）（武汉博士德生物工程有限公司），青霉素- 链霉素、 I 型胶原酶、分散酶
4、、 0.25%胰酶（ Gibco 公司，美国）；细胞计数试剂盒（ cellcountingkit ，CCK）-8 （Kumamoto公司，日本）；台盼蓝染液（Sigma 公司，美国）；平底六孔培养板（ Nunc公司，美国）。紫外光交联仪（Hoefer 公司，美国）；冷冻干燥机（北京博仪康公司） ；ACE200型 200MHz高分辨率超导核磁共振（nuclearmagicresonance ，NMR）仪（ Bruker 公司；德国）；扫描电子显微镜（ scan-ningelectronmicroscope ，SEM）（ FEI 公司，荷兰）；旋转流变仪（Haake公司，德国）；倒置相差显微镜（N
5、ikon 公司，日本）；倒置荧光显微镜及照相系（ Olympus公司，日本）。1.2方法1.2.1 合成 GM将 1gG与 10mLPBS溶液混合，在 50恒温条件下搅拌 20min 以上直至明胶完全溶解， 再缓缓加入浓度为 94%的 MA1mL，继续在 50条件下搅拌，反应持续 1h。随后加入 10的 PBS溶液 40mL，充分混合后置于截留相对分子量为 （8-14 ）103 的透析袋中，在 40 条件下用双蒸水透析 1 周。透析后的溶液用液氮迅速冷冻后， 真空冷冻干燥机冻干处理 1 周，密封保存于 -80 。1.2.2分析 GM1）NMR：取 0.5mgGM、G和 MA分别溶于 D.0，用
6、高分辨率超导 NMR检测三者的结构构象，并对比。 2）SEM：分别扫描GM的断面和表面，观察其表面形貌。1.2.3 制备 GM水凝胶用 60的 PBS将 GM配成质量分数 10%的溶液，0.02um 滤器过滤除菌后，转入超净台内操作。取 10mL该溶液，加入 50mg光引发剂充分混匀， 配成 GM水凝胶准备液。 取 1mLGM水凝胶准备液置于六孔板中， 放入紫外交联仪，选择光强 8mWcm-2、365nm条件下辐照 10min，GM准备液聚合成 GMTk凝胶。1.2.4GM 水凝胶的力学性能质量分数 10%的 GM准备液制备成的直径约 50nm，厚度大于 1mm的 GM水凝胶设为实验组， 质量
7、分数 10%G 溶液制备成的 G凝胶设为对照组，规格同上。选用 37恒温 - 频率扫描模式，用流变仪检测 2 组的黏弹性，间接反映 2 种材料的力学性能。1.2.5培养 hDPC取临床 18-25 岁患者因阻生需要拔除的健康完整的牙齿（四川大学华西口腔医院医学伦理委员会批准且患者知情同意），参照 Gronthos 采用的取材方法，在无菌条件下劈开牙齿，取出牙髓组织，切除根尖 1/3 部分， PBS反复冲洗；将牙髓组织剪碎成小于 1mmx1mmx1mm的组织块，含 3gL-1 的 I 型胶原酶和 4gL-1 的分散酶溶液于 37水浴锅中消化组织块 30min，离心 5min、弃上清，含 20%F
8、BS的 u-MEM培养液调整细胞密度， 混匀后接种于 25cm22培养瓶中， 37、 5%CO2温箱中培养 2d，半量换液，然后每 3d 更换培养基 1 次。待细胞生长融合达 80%时， 0.25g L-1 胰酶消化传代，按 1105 个 mL-1 细胞数接种传代后培养。1.2.6GM水凝胶的细胞毒性和生物相容性1）直接法：取第三代hDPC，用无菌的GM水凝胶准备液制备成细胞浓度为1106 个，mL-I的细胞悬液，在紫外光聚合反应中形成细胞GM水凝胶，随后转移至已添加培养基的六孔板中，常规培养3d 之后，在光镜下观察细胞生长状况。2）间接法：以 GM水凝胶： DMEM培养基 =0.2g ：1m
9、L的比例，密封后置于细胞培养孵箱中 3d，提取 GM水凝胶浸提液作为 A 组；用同样的方法处理 DMEM培养基作为 B组。A、B 两组液体分别加入 10%FBS，1%双抗，培养 hDPSC。3d 后小心弃去孔板中的培养基， PBS清洗后加入数滴 0.4%台盼蓝溶液，室温下染色， 5min 后吸出染液， PBs清洗残留染液，光镜下观察蓝染细胞，评估 GM水凝胶的细胞毒性。 CCK-8法测 A 组和 B 组培养 7d 的细胞增殖曲线，从而评估 GM水凝胶对细胞增殖的影响。2. 结果2.1GM的制备与表征MA改性明胶在光引发剂引发下，经紫外光辐照后形成水凝胶。GM冻干后肉眼可见呈疏松多孔结构，易溶于
10、水， SEM扫描断面可见大小均一数量颇多的孔隙结构（图1 左），孔径大约10um，而表面的图像也能看到致密多孔（图1 右），孔径 15-25um，这种结构在形成水凝胶仍然会保持，孔隙会增大，有利于细胞的黏附长入，并且可保留大量水份支持细胞的营养代谢。从NMR图像（图 2）上来看，可以看到 GM结合了 MA的甲基，在（ 56） 10-6 处形成了代表特征性的 MA酰胺结构的峰，而改性前后明胶特异性的谱图基本保持一致，说明改性对明胶的整体分子结构没有重大影响。2.2GM 水凝胶的力学性能在使用流变仪测量过程中， GM水凝胶的形态没有出现明显变化，而 G凝胶在 37恒温测量台上已经变成溶胶状态。测量
11、结果如图3所示，在 0.01-100Hz 的频率扫描模式下， GM水凝胶储存模量接近于明胶的 10000 倍，说明 GM水凝胶具有弹性，在一定的范围内，随着频率的增加， GM水凝胶的弹性模量和损耗模量几乎保持不变。而 G 凝胶则明显不同，弹性模量与损耗模量则随着频率的增加而大幅度增加。说明在经过甲基丙烯酸改性之后， 减少了明胶分子链之间的滑动，弹性模量和损耗模量受频率的影响大大降低（图 3）。2.3GM水凝胶的细胞毒性和生物相容性用 CCK-8测量 7d 的增殖曲线（图 4），可见 GM浸提液培养的细胞增殖速度略低于 DMEM培养基，但基本保持逐渐递增的趋势，说明 GM水凝胶对 hDPC无明显
12、毒性抑制作用， 在一定程度上能维持细胞的生长。将牙髓细胞 -GM准备液悬液经紫外光引发聚合形成细胞 GM水凝胶，培养 2d 后观察到细胞能在凝胶中维持基本形态。 用 GM水凝胶浸提液培养细胞，与普通 DMEM培养基对照， 2d 后用台盼蓝染色，死细胞被染成蓝色，镜下可见少有细胞蓝染， 其余细胞形态良好 （图 5）。3. 讨论牙组织工程是时下研究热点之一，组织工程牙髓再生能够规避传统根管治疗的弊端， 恢复牙髓的支持营养功能， 避免牙髓丧失造成的牙体变脆崩裂。以往研究中用HA-TCP支架材料复合牙髓细胞再生牙髓牙本质复合体， 在裸鼠皮下得到了很好的效果，但原位再生研究要考虑牙齿根管系统形态多样，错
13、综复杂，应该选用一种可以任意塑形，和天然牙髓组织相近的支架材料，使种子细胞呈三维生长，从而构建再生牙髓。明胶的分子构象为杂乱的多肽链，侧链上有大量的羟基、羧基和氨基。本研究利用 MA与侧链上的氨基结合形成 MA酰胺结构，可以使明胶的一些理化性能得到优化， 比如增加了多孔性， 且在紫外光引发下能聚合成水凝胶。 GM形成凝胶态后，表面依然保留多孔结构，孔径约为 100um，牙髓细胞接种后能较好地黏附、长入、形成三维生长的模型。采用紫外光引发聚合形成的 GM水凝胶在 37条件下性能稳定。用流变仪测量力学性能， GM水凝胶能在 0100Hz的频率递增条件下保持高水平的稳定，机械性能大大优于普通明胶。说明 GM水凝胶可以在体内实验中保持稳定， 抵抗一定的机械作用力。 另一方面，通过浸提液培养法及 CCK-8法检测，间接证明了本材料具有良好的生物相容性。光镜下观察牙髓细胞能在水凝胶中均匀分布，活性良好。牙髓组织需要丰富的血供，而曾有研究使用 GM水凝胶构建微血管，证明了它的可行性。 最重要的一点， 这种水凝胶的力学性能以及多孔性可以随着反应条件的改变而调节， 凝胶时间也可以通过光引发剂的浓度而变化，这为后期的体内实验以及具体应用上提供了一定灵活的空间。综上所述，这种MA改性明胶水凝胶有望成为一种良好的牙髓再生组织工程支架材料。