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1、工程菌的高效表达和稳定性,工程菌简介 用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系一般称为“工程菌”。,工程菌的高效表达,基因工程的最终目的是在一个合适的系统中， 使外源基因高效表达，从而生产有价值的蛋白 质产品。表达系统有原核系统和真核系统。,原核生物基因表达的特点：（1）原核生物只有一种RNA聚合酶，识别原核的启动子，催化所有RNA合成。（2）原核生物的基因表达是以操纵子为单位。操纵子是数个相关的结构基因及其调控区的结合，是一个基因表达的协同单位。（3）由于原核生物无核膜，所以转录与翻译是耦联的，二者也是连续进行的。原核生物染色体DNA是裸露的环型DNA，转录成mRNA后，可直接
2、在胞浆中与核糖体结合翻译成蛋白质。每个核糖体可独立完成一条链的合成，多核糖体可同时在1条mRNA合成多条肽链，大大提高了翻译效率。,（4）原核基因不含内含子（intron），没有转录后加工过程。 （5）原核生物基因表达的控制主要是在转录水平。对RNA合成的调控有两种方式：启始控制（启动子控制）和终止控制（衰减子控制）。 （6）在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，有一个转译启始密码子及同16S核糖体RNA3末端碱基互补的序列，即SD序列，真核基因则无此序列。,外源基因在原核中表达的关键： （1）通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白； （2）外源基因不能带有intr
3、on； （3）利用原核细胞的强启动子和SD序列等控制外源基因的表达； （4）外援基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架； （5）利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止表达的外源基因产物对宿主菌的毒害。,外源基因在真核细胞中的表达 哺乳动物细胞做宿主表达体系的优点： （1）能识别和除去外源基因中的内含子，剪 切加工成成熟的mRNA； （2）表达的蛋白质在翻译后被加工的机会多 （如糖基化），更接近于体内构型； （3）易被重组DNA转染，具有遗传稳定性和 可重复性； （4）经转化的哺乳动物细胞可将表达的产物 分泌到培养基中，提纯工艺简单，成本低。,影响工程菌发酵的原因,对发酵影响较
4、大的几个因素有： 培养基的影响；接种量的影响；温度的影响； 溶解氧的影响；诱导时机的影响；诱导表达程 序的影响；pH的影响。,1.培养基的影响 培养基的组成既要提高工程菌的生长速率，又 要保持工程菌的稳定性，从而使外源基因高效 表达。,2.接种量的影响 接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期。接 种量小，菌体延迟期较长，使菌龄老化，不利 于外源基因表达；接种量大，可缩短生长延迟 期，菌体迅速繁衍，很快进入对数生长期，适 于表达外源基因；接种量过高，使菌体生长过 快，代谢物积累过多，反而会抑制后期菌体的 生长。,3.温度的影响 温度对发酵过程的影响是多方面的。它影响各 种酶的反应速度，改变菌体代谢
5、产物的反应方 向，影响代谢调控机制。适宜的发酵温度是既 适合菌体的生长，又适合代谢产物合成的温度 。高温或低温都会使发酵异常，影响终产物的 形成并导致减产。温度还影响蛋白质的活性和 包含体的形成。,4.溶解氧的影响 对于好氧发酵,溶解氧浓度是重要的参数。好氧微生物利用溶解 于培养液中的氧气进行呼吸。若能提高溶氧速度和氧的利用率 ，则能提高发酵产率。发酵时，随溶解氧浓度的下降，细胞生 长减慢，发酵后期下降幅度更大。外源基因的高效表达需要大 量的能量，促进细胞的呼吸作用，提高对氧的需求。维持较高 的溶解氧值，才能提高工程菌的生长，利于外源蛋白产物的形 成。采用调节搅拌转速的方法,可改变培养过程中的
6、氧供给，提 高活菌产量。,5. pH的影响 根据工程菌的生长和代谢情况，对pH进行适当 的调节。如采取两段培养工艺，培养前期重点 是优化工程菌的生长条件，培养后期重点是优 化外源蛋白的表达条件。,6.诱导时机的影响 一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表 达。在对数生长期，细胞快速繁殖，这时菌体 数目倍增，对营养和氧需求量急增，营养和氧 成了菌群旺盛代谢的限制因素。 7.诱导表达程序的影响 热诱导的程序提高外源蛋白表达量。,基因工程菌的不稳定性,基因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳定的现象。 质粒不稳定可分为： 分裂不稳定 结构不稳定,分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现
7、象。 结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变,导致质粒不稳定的常见的三个因素： 1.含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率； 2.这两种菌比数率差异的大小; 3.插入的外源基因影响了质粒稳定区的结构 。,对同一工程菌控制不同的比生长数率可改变质粒的拷贝数： 低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高如增加工程菌质粒拷贝数可提高稳定性； 高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低但对稳定性不利。,质粒稳定性的分析方法,样品,不含抗性标记抗生素 平 板 培 养基,10-12h,100个菌落,含抗性标记抗生素 平 板 培 养 基,10-12h,统计生长菌落数,重复三次,计算比值
8、 (稳定性stability),提高质粒稳定性的方法,1.选择合适宿主菌 宿主菌的比生长速率、基因重组系统的特性、染色体上是否有与质粒和外源基因同源序列等都会影响质粒的稳定性。,2.选择合适的载体 改造、构建能稳定表达的质粒载体是构建工程菌的重要一环。针对不同的载体及不同的目的采取不同的策略。 3.选择压力 从遗传学来说，选择意味着利用某些生长条件使得只有那些具有一定遗传特性的细胞才能够生长。,4.分段控制培养 提高质粒稳定性的目的是为了提高克隆菌的发酵生产率，但外源基因表达水平越高，重组质粒往往越不稳定。 可采用两阶段培养法，即在发酵前期控制外源基因不过量表达，使重组质粒稳定地遗传；到后期通
9、过提高质粒的拷贝数或转录、翻译效率使外源基因高效表达。,5.控制培养条件 对于一个已经组建完成的工程菌来说，选择最适的培养条件是进行工业化生产的关键 步骤。 环境因素对质粒稳定性的影响机制错综复杂，许多尚属未知。 在众多的环境因素中，培养基的组成、培养温度、菌体的比生长速率3个方面尤其重要。,1）培养基的组成,培养基对克隆菌稳定性的影响 培养基 克隆菌 F20-25 不稳定型 PBB W3110trpAE1trpR tnaA 7% 结构性 MM (RSF 2124-trp) 99% 结构性 PBB W3110 trpAE1 trpRam27 12% 分配性 MM (pSC101-trp) 48
10、% 分配性,2）培养温度 对于温度敏感性质粒，为了控制在生长前期其外源基因不表达，一般采用二阶段温度培养系统，即在菌种生长阶段，采用较低的培养温度，当菌体生长至适宜浓度和生长时期时，提高温度进行诱导，使外源基因表达。重组工程菌的生长和产物合成时的PH往往不同。,3）菌体比生长速率 比生长速率对重组质粒稳定性的影响结果不尽一致，并可能与克隆菌本身和培养条件有关。 例如: 在酵母系统中，大则质粒pJDB248稳定性高。 如果不含重组质粒的宿主细胞不比含有重组质粒的工程菌生长快，则重组质粒的丢失也不会导致非常严重的后果；调整这两种菌的比生长速率可以提高重组质粒的稳定性。但很难达到。在某些情况下，可以
11、利用分解代谢物效应控制菌的比生长速率，降低值，提高重组质粒的稳定性。,比生长速率,比生长速率为表征微生物生长速率的一个参数,其大小为0.693除以倍增时间td（菌体量倍增）。 推算过程：假定在任何时间（t），微生物细胞数目的增长速率（dN/dt）正比于已经存在的总细胞数目（N），则得：dN/dt=N。 经积分得：lnNt-lnN0=t，对于一倍增时间，t=td , Nt=2N0的培养物：ln2N0-lnN0=td 。易得：=ln2/td 。 参数含义： 比生长速率，单位h-1 t时间，单位h N任何时间处微生物细胞量 Nt开始培养t时间过后生物细胞量 N0开始时微生物细胞量 td倍增时间，即为
12、微生物细胞量变为原来的两倍所需的时间,6.固定化 固定化技术包括固定化酶技术与固定化微生物技术。固定化微生物技术是用化学或物理手段将游离微生物定位于限定的空间区域,以提高微生物细胞的浓度,使其保持较高的生物活性并反复利用的方法。,良好固定化细胞方法的条件： 1）应该能够控制固定化细胞的大小和空隙度； 2）原料易得、成本较低，方法简便、易行，载体对细胞是惰性的，固定过程温和，对细胞损伤轻； 3）固定化细胞应具有稳定的网状结构，在所使用的pH值和温度下，不会被破坏； 4）在反应器内长时间运转过程中，固定化细胞具有良好的机械稳定性和化学稳定性； 5）固定化细胞应使底物、产物和其他代谢物能够自由扩散，因为产物和其他代谢产物常能抑制细胞的酶反应； 6）单位体积的固定化细胞应拥有尽可能多的细胞。,固定化细胞的制备方法 常用的有吸附法、包埋法、共价结合法、交 联法、多孔物质包络法、超过滤法等，其中 包埋法最为普遍。,