1、细胞培养基本技术概述细胞培养基本技术概述细胞的原代培养细胞的原代培养原代细胞培养原理原代细胞培养原理细胞培养细胞培养细胞培养细胞培养是模拟机体内生理条件，将细胞从机是模拟机体内生理条件，将细胞从机是模拟机体内生理条件，将细胞从机是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。
2、胞工程等问题的研究。胞工程等问题的研究。胞工程等问题的研究。由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养养养养。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。似，适用于研究。似，适用于研究。似，适用于研究。幼稚状态的组织和细胞幼稚状态的组织和细胞幼稚状态的组织和细胞幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼，如：动物的胚胎、幼，如：动物的胚胎、幼，如：动物的胚胎
3、幼仔的脏器等更容易进行原代培养仔的脏器等更容易进行原代培养仔的脏器等更容易进行原代培养仔的脏器等更容易进行原代培养原代细胞培养操作（鼠胎组织细胞培养为例）原代细胞培养操作（鼠胎组织细胞培养为例）原代细胞培养操作（鼠胎组织细胞培养为例）原代细胞培养操作（鼠胎组织细胞培养为例）取材取材取材取材：用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠浸入盛有浸入盛有浸入盛有浸入盛有75757575乙醇乙醇乙醇乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放的烧杯中数秒钟消毒，取出后放的烧杯中数秒钟消毒，取出后放的烧杯
4、中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用在大平皿中携入超净台。用在大平皿中携入超净台。用在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀消过毒的剪刀消过毒的剪刀消过毒的剪刀在躯干中在躯干中在躯干中在躯干中部环行剪开皮肤，剖腹取出子宫置于无菌平皿中。部环行剪开皮肤，剖腹取出子宫置于无菌平皿中。部环行剪开皮肤，剖腹取出子宫置于无菌平皿中。部环行剪开皮肤，剖腹取出子宫置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀剪开子宫，取出用消过毒的剪刀剪开子宫，取出用消过毒的剪刀剪开子宫，取出用消过毒的剪刀剪开子宫，取出鼠胎，剪去头、爪，鼠胎，剪去头、爪，鼠胎，剪去头、爪，鼠胎，剪去头、爪，以平衡盐溶液洗去血污以平衡盐溶液洗去血污以
5、平衡盐溶液洗去血污以平衡盐溶液洗去血污原代细胞培养操作原代细胞培养操作切割切割切割切割：用用用用平衡盐溶液平衡盐溶液平衡盐溶液平衡盐溶液将取出的组织块清洗三次，然将取出的组织块清洗三次，然将取出的组织块清洗三次，然将取出的组织块清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复后用眼科手术剪刀仔细将组织反复后用眼科手术剪刀仔细将组织反复后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎剪碎剪碎剪碎，直到成，直到成，直到成，直到成1mm1mm1mm1mm3 3 3 3左右的小块，再左右的小块，再左右的小块，再左右的小块，再用用用用平衡盐溶液平衡盐溶液平衡盐溶液平衡盐溶液清洗清洗清洗清洗，洗到组织，洗到组织，洗到组织，洗
6、到组织块发白为止。块发白为止。块发白为止。块发白为止。静置静置静置静置数分钟，使组织块自然沉淀到管数分钟，使组织块自然沉淀到管数分钟，使组织块自然沉淀到管数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清（或离心，底，弃去上清（或离心，底，弃去上清（或离心，底，弃去上清（或离心，8008008008001000100010001000转分，转分，转分，转分，5 5 5 5分钟）分钟）分钟）分钟）原代细胞培养操作原代细胞培养操作组织块培养法：组织块培养法：组织块培养法：组织块培养法：用吸管吸取小块，在培养瓶底部均匀摆开，用吸管吸取小块，在培养瓶底部均匀摆开，用吸管吸取小块，在培养瓶底部均匀摆开，用吸管吸取
7、小块，在培养瓶底部均匀摆开，翻翻翻翻转培养瓶转培养瓶转培养瓶转培养瓶，加入，加入，加入，加入2 2 2 23ml3ml3ml3ml培养液，培养培养液，培养培养液，培养培养液，培养4 4 4 45h5h5h5h后，待后，待后，待后，待组织卡能牢固贴于瓶壁，再轻轻组织卡能牢固贴于瓶壁，再轻轻组织卡能牢固贴于瓶壁，再轻轻组织卡能牢固贴于瓶壁，再轻轻翻转培养瓶翻转培养瓶翻转培养瓶翻转培养瓶，静，静，静，静置培养置培养置培养置培养 3 3 3 3天后观察，在组织块边缘是否有细胞长出，天后观察，在组织块边缘是否有细胞长出，天后观察，在组织块边缘是否有细胞长出，天后观察，在组织块边缘是否有细胞长出，根据培养
8、液颜色，适当补充或更换培养液，根据培养液颜色，适当补充或更换培养液，根据培养液颜色，适当补充或更换培养液，根据培养液颜色，适当补充或更换培养液，1010101015d15d15d15d可长成单层，此时，可传代培养。可长成单层，此时，可传代培养。可长成单层，此时，可传代培养。可长成单层，此时，可传代培养。原代细胞培养操作原代细胞培养操作消化法：消化法：消化法：消化法：加入加入加入加入0.250.250.250.25胰蛋白酶消化液（胰蛋白酶消化液（胰蛋白酶消化液（胰蛋白酶消化液（5-105-105-105-10倍量）倍量）倍量）倍量），与组织与组织与组织与组织块混匀。置块混匀。置块混匀。置块混匀。
9、置37373737水浴水浴水浴水浴，观察消化情况（每隔几分钟，观察消化情况（每隔几分钟，观察消化情况（每隔几分钟，观察消化情况（每隔几分钟摇动一下试管），组织块变松散，颜色略白时，拿摇动一下试管），组织块变松散，颜色略白时，拿摇动一下试管），组织块变松散，颜色略白时，拿摇动一下试管），组织块变松散，颜色略白时，拿出反复出反复出反复出反复吹打吹打吹打吹打，加入培养液，加入培养液，加入培养液，加入培养液终止消化终止消化终止消化终止消化。过滤。过滤。过滤。过滤。离心离心离心离心，吸去上清，（可反复一次），沉淀加入，吸去上清，（可反复一次），沉淀加入，吸去上清，（可反复一次），沉淀加入，吸去上清，（可
10、反复一次），沉淀加入3 3 3 35 5 5 510ml10ml10ml10ml细胞细胞细胞细胞培养液培养液培养液培养液，用吸管吹打混匀，用吸管吹打混匀，用吸管吹打混匀，用吸管吹打混匀，计数计数计数计数，细胞，细胞，细胞，细胞浓度为浓度为浓度为浓度为5 510105,5,移入培养瓶中，置于二氧化碳培养箱移入培养瓶中，置于二氧化碳培养箱移入培养瓶中，置于二氧化碳培养箱移入培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养中培养中培养中培养血细胞记数板血细胞记数板血细胞计数板的构造血细胞计数板的构造细胞计数区：细胞计数区：四个角得大方格四个角得大方格16个中格个中格（44）原则：计左不计右，计原则：计左不计右，计
11、上不计下，防止重复计上不计下，防止重复计数。数。公式（细胞悬液的细胞数）（细胞悬液的细胞数）/ml/ml（四个大格子细胞四个大格子细胞数数/4)/4)稀释倍数稀释倍数104104 说明：说明：公式中乘以公式中乘以104104因为计数板中每一个大格的体积因为计数板中每一个大格的体积为：为：1.0mm1.0mm（长）（长）1.0mm1.0mm（宽）（宽）0.1mm0.1mm（高）（高）0.1mm30.1mm3消化培养法的主要过程消化培养法的主要过程原代细胞培养结果原代细胞培养结果细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长始生长如接种的细胞密度适宜，如接种的细胞密
12、度适宜，5 5天到一周即可天到一周即可形成单层形成单层贴壁细胞的生长规律贴壁细胞的生长规律贴壁过程贴壁过程传代细胞培养原理传代细胞培养原理培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以从容器中取出，以从容器中取出，以从容器中取出，以1:21:21:21:2或或或或l:3l:3l:3l:
13、3以上的比率转移到另以上的比率转移到另以上的比率转移到另以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养外的容器中进行培养，即为传代培养外的容器中进行培养，即为传代培养外的容器中进行培养，即为传代培养细胞细胞细胞细胞“一代一代一代一代”指指指指从细胞接种到分离再培养的一段从细胞接种到分离再培养的一段从细胞接种到分离再培养的一段从细胞接种到分离再培养的一段期间期间期间期间，与细胞世代或倍增不同，与细胞世代或倍增不同，与细胞世代或倍增不同，与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞在一代中，细胞在一代中，细胞在一代中，细胞培增培增培增培增3 3 3 36 6 6 6次次次次培养细胞一代生长过程培养细胞
14、一代生长过程（一）潜伏期（潜伏期（Latent phaseLatent phase）：细胞从接种到贴壁生长繁殖的一段时间。二倍体细胞该期时间长（24-96h）连续细胞系时间短（10-30min）（二）指数生长期：细胞增殖最旺盛时期，一般用细胞分裂指数（Mitotic index，MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂指数介于0.1-0.5%，且受细胞种类培养液成分、pH、温度等影响。指数生长期是指数生长期是细胞活力最好细胞活力最好的时期，可对的时期，可对细胞进行各种实验细胞进行各种实验指数生长期持续指数生长期持续3-5d3-5d后，随细胞数量不断后，随细胞数量不断
15、增多，生长空间日趋减少，细胞相互接触增多，生长空间日趋减少，细胞相互接触汇合成片，呈现汇合成片，呈现接触抑制接触抑制。而恶性细胞则而恶性细胞则无接触抑制现象。无接触抑制现象。癌细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢癌细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢产物的影响而发生产物的影响而发生密度抑制密度抑制（三）停滞期：即细胞数量达到饱和密度后，细胞与营养液的交换面积减少，代谢产物积累，pH下降细胞停止增殖，进入停滞期。在此时应及时进行传代，否则因细胞中毒受损，大量细胞出现死亡，至少再传1-2代后，细胞才能恢复。细胞的传代培养操作细胞的传代培养操作1 1、悬浮细胞、悬浮细胞 可采用加入等量新鲜培养基后直接吹
16、可采用加入等量新鲜培养基后直接吹打分散进行传代，或用离心法后，加入新打分散进行传代，或用离心法后，加入新培养基后再吹打分散进行传代培养基后再吹打分散进行传代2 2、贴壁细胞（重点）、贴壁细胞（重点）贴壁细胞传代培养过程贴壁细胞传代培养过程1、实验准备：、实验准备：细胞培养用的器材灭菌、超净工作细胞培养用的器材灭菌、超净工作台准备、实际预温、操作人员准备。台准备、实际预温、操作人员准备。2、倒去瓶中的旧培养液、倒去瓶中的旧培养液，加入，加入23ml的的D-Hanks液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在细胞表面的液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在细胞表面的碎片。碎片。3、加入、加入2滴管滴管0.25
17、胰蛋白酶胰蛋白酶消化液，消化消化液，消化23min，倒置显微镜下观察，待细胞单层收缩突起，倒置显微镜下观察，待细胞单层收缩突起出现空隙时，出现空隙时，倒去酶液倒去酶液。刚加入合适过头4、加入加入12滴管滴管含有血清的培养液含有血清的培养液，反，反复复吹打细胞吹打细胞，使其成细胞悬液。，使其成细胞悬液。5、以以1：2或或1：3进行进行分装分装，补充新鲜培，补充新鲜培养基，并在培养瓶上做好标记，注明代号、养基，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，日期，轻轻摇匀，37CO2培养箱培养。培养箱培养。6、观察：、观察：细胞培养细胞培养24h后，即可观察培养后，即可观察培养液的颜色及细胞的生长
18、情况。液的颜色及细胞的生长情况。注意事项注意事项1 1传代培养时要注意传代培养时要注意无菌操作无菌操作并防止细胞之间并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开。用一套器材。培养用液应严格分开。2 2传代时间的掌握传代时间的掌握：每天观察细胞形态，掌握：每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。折光性好，生长致密时即可传代。3 3、消化
19、时间的掌握消化时间的掌握哺乳动物细胞冷冻保存哺乳动物细胞冷冻保存冷冻保存要点冷冻保存要点冷冻保存要点冷冻保存要点冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90909090，无微生物污染。细胞浓度控制在：无微生物污染。细胞浓度控制在：无微生物污染。细胞浓度控制在：无微生物污染。细胞浓度控制在：1 1 1 1101010107 7 7 75 5 5 5101010107 7 7 7/ml/ml/ml/ml。冷冻过程要缓慢。冷冻过程要缓慢。冷冻过程要缓慢。冷冻过程要缓慢。4 304 304 304
20、3060 60 60 60 分钟分钟分钟分钟-20 20 20 20 30 30 30 30 分钟分钟分钟分钟 -80-80-80-80 1616161618 18 18 18 小时（或过夜）小时（或过夜）小时（或过夜）小时（或过夜）液氮长期保存液氮长期保存液氮长期保存液氮长期保存常用细胞冷冻保存液常用细胞冷冻保存液常用细胞冷冻保存液常用细胞冷冻保存液10101010DMSO DMSO DMSO DMSO 完全细胞生长培养液（完全细胞生长培养液（完全细胞生长培养液（完全细胞生长培养液（20202020血清血清血清血清基础培养液）基础培养液）基础培养液）基础培养液）10101010甘油甘油甘油甘
21、油 完全细胞生长培养液（完全细胞生长培养液（完全细胞生长培养液（完全细胞生长培养液（20202020血清血清血清血清基础培养液）基础培养液）基础培养液）基础培养液）冷冻保存细胞的解冻与复苏要点冷冻保存细胞的解冻与复苏要点快速解冻快速解冻快速解冻快速解冻冻存细胞从液氮中取出后，立即放入冻存细胞从液氮中取出后，立即放入冻存细胞从液氮中取出后，立即放入冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37373737水浴中，水浴中，水浴中，水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在轻轻摇动冷冻管，使其在轻轻摇动冷冻管，使其在轻轻摇动冷冻管，使其在1 1 1 1 分钟分钟分钟分钟内全部融化（不要内全部融化（不要内全部融化（不要内全
22、部融化（不要超过超过超过超过3 3 3 3 分钟）分钟）分钟）分钟）解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养，的细胞培养瓶中直接进行培养，的细胞培养瓶中直接进行培养，的细胞培养瓶中直接进行培养，24242424小时后再小时后再小时后再小时后再用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除DMSODMSODMSODMSO如果细胞对冷冻保护剂特别敏感如果细胞
23、对冷冻保护剂特别敏感如果细胞对冷冻保护剂特别敏感如果细胞对冷冻保护剂特别敏感解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中再接种到含完全生长培养液的培养瓶中再接种到含完全生长培养液的培养瓶中再接种到含完全生长培养液的培养瓶中解冻冷冻保存细胞的离心方法解冻冷冻保存细胞的离心方法从液氮中取出冻存的细胞，从液氮中取出冻存的细胞，从液氮中取出冻存的细胞，从液氮中取出冻存的细胞，立即放入立即放入立即放入立即放入37373737水浴中水浴中水浴
24、中水浴中快速解冻快速解冻快速解冻快速解冻将将将将1 1 1 12ml 2ml 2ml 2ml 冻存细胞液加入到冻存细胞液加入到冻存细胞液加入到冻存细胞液加入到25ml 25ml 25ml 25ml 新鲜完全细胞新鲜完全细胞新鲜完全细胞新鲜完全细胞生长培养液中，轻轻混匀生长培养液中，轻轻混匀生长培养液中，轻轻混匀生长培养液中，轻轻混匀离心离心离心离心2 2 2 23 3 3 3 分钟，弃上清液分钟，弃上清液分钟，弃上清液分钟，弃上清液用完全生长培养液轻轻悬浮细胞团，并计数细胞用完全生长培养液轻轻悬浮细胞团，并计数细胞用完全生长培养液轻轻悬浮细胞团，并计数细胞用完全生长培养液轻轻悬浮细胞团，并计数
25、细胞接种细胞到培养瓶中，起始密度为接种细胞到培养瓶中，起始密度为接种细胞到培养瓶中，起始密度为接种细胞到培养瓶中，起始密度为3 3 3 3105/ml105/ml105/ml105/ml。细胞培养常见问题解答细胞培养常见问题解答培养液培养液pH pH 值变化太快值变化太快培养瓶盖拧得太紧培养瓶盖拧得太紧松开瓶盖松开瓶盖松开瓶盖松开瓶盖1/4 1/4 1/4 1/4 圈圈圈圈NaHCO3 NaHCO3 缓冲系统缓冲力不足缓冲系统缓冲力不足加加加加HEPES HEPES HEPES HEPES 缓冲液至缓冲液至缓冲液至缓冲液至10 10 10 10 到到到到25mM 25mM 25mM 25mM
26、终浓度终浓度终浓度终浓度 细菌、酵母或真菌污染细菌、酵母或真菌污染丢弃培养物或用抗生素除菌丢弃培养物或用抗生素除菌丢弃培养物或用抗生素除菌丢弃培养物或用抗生素除菌培养液出现沉淀，培养液出现沉淀，但但pHpH值不变值不变用洗涤剂清洗后残留磷酸盐将培养基成用洗涤剂清洗后残留磷酸盐将培养基成分沉淀下来分沉淀下来用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后除菌用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后除菌用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后除菌用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后除菌冰冻保存培养液冰冻保存培养液将培养液加热到将培养液加热到将培养液加热到将培养液加热到37373737，摇动使其溶解如沉，摇动使其溶解如沉，摇动使其溶解
27、如沉，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液淀仍然存在，丢弃培养液淀仍然存在，丢弃培养液淀仍然存在，丢弃培养液培养液出现沉淀，同时培养液出现沉淀，同时pH pH 发生变化发生变化细菌或真菌污染细菌或真菌污染丢弃培养物丢弃培养物丢弃培养物丢弃培养物抗生素除菌抗生素除菌抗生素除菌抗生素除菌培养细胞不贴壁培养细胞不贴壁胰蛋白酶消化过度胰蛋白酶消化过度缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度支原体污染支原体污染分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养分离培
28、养物，检测支原体。清洁支架和培养分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物箱。如发现支原体污染，丢弃培养物箱。如发现支原体污染，丢弃培养物箱。如发现支原体污染，丢弃培养物培养液中无贴壁因子培养液中无贴壁因子原代细胞培养物污染原代细胞培养物污染原代培养组织在进入培养前已污染原代培养组织在进入培养前已污染培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液反复冲洗组织反复冲洗组织反复冲洗组织反复冲洗组织培养细胞生长减慢培养细胞生长减慢 由于更换不同培养液或血清由于更换不同培养液或血清由于
29、更换不同培养液或血清由于更换不同培养液或血清比较新培养液与原培养液成分，比较新血清与旧血清支持细比较新培养液与原培养液成分，比较新血清与旧血清支持细比较新培养液与原培养液成分，比较新血清与旧血清支持细比较新培养液与原培养液成分，比较新血清与旧血清支持细胞生长实验胞生长实验胞生长实验胞生长实验增加起始培养细胞浓度增加起始培养细胞浓度增加起始培养细胞浓度增加起始培养细胞浓度 培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或生长因培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或生长因培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或生长因培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或生长因子耗尽或缺乏或已被破坏子耗尽或缺乏或已被破
30、坏子耗尽或缺乏或已被破坏子耗尽或缺乏或已被破坏让细胞逐渐适应新培养液。换入新鲜配制培养液。补加谷氨让细胞逐渐适应新培养液。换入新鲜配制培养液。补加谷氨让细胞逐渐适应新培养液。换入新鲜配制培养液。补加谷氨让细胞逐渐适应新培养液。换入新鲜配制培养液。补加谷氨酰胺或生长因子酰胺或生长因子酰胺或生长因子酰胺或生长因子 培养物中有少量细菌或真菌污染培养物中有少量细菌或真菌污染培养物中有少量细菌或真菌污染培养物中有少量细菌或真菌污染用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培养物。或用抗用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培养物。或用抗用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培养物。或用抗用无抗生素培养液培养
31、如发现污染，丢弃培养物。或用抗生素除菌。生素除菌。生素除菌。生素除菌。试剂保存不当试剂保存不当试剂保存不当试剂保存不当血清需保存在血清需保存在血清需保存在血清需保存在-5-5-5-5 到到到到-20-20-20-20。培养液需在。培养液需在。培养液需在。培养液需在2 2 2 28888避光保存。避光保存。避光保存。避光保存。含血清完全培养液在含血清完全培养液在含血清完全培养液在含血清完全培养液在2-82-82-82-8保存，并在保存，并在保存，并在保存，并在2 2 2 2 周内用完周内用完周内用完周内用完欲将一般动物细胞离心下来，其欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？离心速率应
32、为多少转速？欲回收动物细胞，其离心速率一般为欲回收动物细胞，其离心速率一般为300 xg(300 xg(约约1,000rpm)1,000rpm)，5-10 5-10 分钟，分钟，过高之转速，过高之转速，将造成细胞死亡将造成细胞死亡 细胞冷冻管解冻培养时，细胞冷冻管解冻培养时，是否是否应马上去除应马上去除DMSODMSO？除少数特别注明对除少数特别注明对DMSO DMSO 敏感之细胞外，敏感之细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有在解冻之后，应直接放入含有10-15ml10-15ml新新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换鲜培养基之培
33、养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除新鲜培养基以去除DMSO DMSO 即可，如此可避即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题问题支原体支原体(mycoplasmamycoplasma)污染的细胞，是污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？否能以肉眼观察出异状？不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。无法以其外观分辨之。侦测出细胞株有支原体污染时，侦测出细胞株有支原体污染时，该如何处理？该如何处理？直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株直接灭菌后丢弃，以避免污染
34、其它细胞株为何培养基保存于为何培养基保存于4 C 4 C 冰箱中，冰箱中，颜色会偏暗颜色会偏暗红色，红色，且且pHpH值会越来越偏碱性？值会越来越偏碱性？培养基保存于培养基保存于4C 4C 冰箱中，冰箱中，培养基内之培养基内之CO2 CO2 会会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂中之酸碱指示剂(通常为通常为phenol red)phenol red)的颜色也会的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果，将随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果，将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，可造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时
35、可以通入无菌过滤之以通入无菌过滤之CO2CO2，以调整，以调整pH pH 值。值。细胞培养的污染和检测细胞培养的污染和检测细胞污染的种类细胞污染的种类 细菌、酵母菌、霉菌和病毒细菌、酵母菌、霉菌和病毒污染源污染源 无菌操作技术不当无菌操作技术不当 操作室环境不佳操作室环境不佳 污染之血清污染之血清 污染之细胞污染之细胞 细菌培养液被洋葱佰克霍尔德菌污染了。细菌培养液被洋葱佰克霍尔德菌污染了。洋葱佰克霍尔德菌（洋葱佰克霍尔德菌（Burkholderiacepacia）原属假单）原属假单胞菌属，是植物病原菌。胞菌属，是植物病原菌。白色念珠菌污染白色念珠菌污染 真菌感染真菌感染支原体污染电镜照片支原体污染电镜照片,煎蛋状和其他形状煎蛋状和其他形状细菌和真菌的污染和检测细菌和真菌的污染和检测肉眼直接观察法肉眼直接观察法培养检查法培养检查法显微镜观察法显微镜观察法支原体的污染和检测支原体的污染和检测Hayflick培养基直接培养法培养基直接培养法DNA荧光染色法荧光染色法PCR方法方法相差显微镜观察法相差显微镜观察法测出细胞株有支原体污染时，测出细胞株有支原体污染时，应直接灭菌后丢弃，以避免污应直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。染其它细胞株。
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