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1、（一 ）【摘要】 ： 间充质干细胞具有高度自我更新能力，能够分化为各种类型的细胞。近 20 年间充质细胞在软骨组织工程中得到应用，动物实验显示了良好的软骨修复潜能，成为软骨组织工程的理想的细胞来源。组织工程和干细胞技术已经确定为对软骨缺损有效的治疗方法，间充质干细胞有望在软骨组织工程中得到更广泛的应用。本文对间充质干细胞的特性和在组织工程中的应用进行了综述。【关键词】间充质干细胞骨性关节炎组织工程自体软骨细胞移植术Abstract：Mesenchymalstemcellshasanextensiveproliferativepotentialandanabilitytodifferentiat
2、eintovariou scelltypes.Inrecentyears,masenchymalstemcellshavebeenappliedincartilagetissueengineeringand theyhaveshownsignificantpotenitalforcarriagerepairinanimalmodels,andarebeingusedasanidealce llsourceincartilagetissueengineering.Tissueengineeringandstemcelltechnologieshaveestablishedth emselvesa
3、sapprovedapproachesforcartilagerepairandeventuallywillbewidelyusedintheclinicalprac tive.Thispaperdiscussesthecharacteristicsandtheapplicationofmesenchymalstemcellsincartilagetis sueengineering. Keywords：mesenchymalstemcells;osteoarthritis;tissueengineering;autologouschondrocytetransplantation 由于关节软
4、骨的修复能力有限，软骨缺损的治疗存在巨大挑战。自体软骨细胞移植术 （autologouschondrocytetransplantation） 是软骨组织工程中的一种方法，目前治疗软骨缺损比 较有效。软骨组织工程最常应用软骨细胞，由于存在供区并发症、软骨细胞的去分化和生命周期有限等问题，近 20 年间充质干细胞在结缔组织工程中得到应用，成为理想的细胞来源。间充质细胞已经在动物模型中显示了良好的软骨修复潜能。 1 自体软骨细胞移植术 修复软骨缺损有效的方法是自体软骨细胞移植术（ACTb这种手术方法于20世纪80年代由瑞典学者报道，用于治疗骨性关节炎。应用ACT治疗的病人在全世界已经超过20000
5、例。Peterson等1随访39年的结果显示病人的疼痛明显减轻，切取的12个活检标本中有8 个显示透明软骨特征，关节软骨修复达到持久的修复效果，如果2 年后植入物不失败，在38年的生存率接近 100%。 第2代自体软骨细胞移植术应用生物材料膜（例如双层I型胶原/出型胶原膜）代替骨膜瓣以固定填充缺损部位的软骨细胞。目的是减少与使用骨膜瓣相关的骨膜反应例如骨膜肥大。第3 代软骨细胞移植术是将软骨细胞在三维支架环境中培养，构建成新的软骨样的组织后再移植修复软骨。 应用 ACT 面临的主要问题包括供区部位的并发症，软骨细胞在体外扩增的去分化导致植入 体内后不能形成软骨，纤维软骨修复以及机械性能较差，关
6、节的修复部位整合不良等2 。2 间充质干细胞与组织工程 成功的组织工程包括3 部份： （ 1）能够提供合适的三维环境的支架；（ 2）能够分化和保持特殊细胞表型的细胞；（ 3） 添加合适的生物活性物质如生长因子、细胞因子，作为细胞特异分化的合适的刺激。 软骨组织工程面临的主要问题是获得有活力的和分化良好的软骨细胞。间充质干细胞有软骨分化潜能，容易在体外大量获取并扩增而不丢失分化能力，是软骨再生的理想细胞来源。 2.1 间充质干细胞的来源、分离和特性 间充质干细胞来源于中胚层，具有高度自我更新能力，与造血干细胞不同，能够分化为各种类型的细胞，包括骨细胞，脂肪细胞，软骨细胞，肌细胞，心肌细胞和神经元
7、。它在保持骨 髓的动态平衡和调节造血细胞系和非造血细胞系的成熟方面起着重要作用，广泛存在于全身结缔组织和器官间质中。从骨髓，脐带血，脂肪组织和外周血中能够分离出间充质干细胞。间充质干细胞占骨髓中有核细胞总数的2%3%,容易从骨髓中分离出来， 在体外扩增几代而不丢失分化潜能 3 。 间充质干细胞的主要特征是在体外条件下贴附在塑料上，体外培养扩增呈成纤维细胞形态，表达几种粘附分子，间充质干细胞存在的标记物包括CD105， CD73，CD90,不表达CD45, CD34和其他造血干细胞标记物3,4。脐带血是间充质干细胞的良好 来源， 脐带血来源的间充质干细胞能够分化为多种类型细胞，例如内皮细胞，神经
8、元，平滑肌细胞，脂肪细胞，成软骨细胞和成骨细胞5 。脂肪也是间充质干细胞的丰富来源6 ，脂肪来源的间充质干细胞在体外能够分化为不同系的细胞，包括脂肪系，软骨系，肌细胞系和成骨细胞系，与骨髓来源的间充质干细胞相比成软骨细胞的能力低7 。 Wagner 等8应用含有22 种细胞表面抗原标记物的仪器板的流式细胞计量术，发现从脂肪组织，脐带血和骨髓中分离出来的间充质干细胞的全部基因表达表型相同。用同样的方法培养的来源于不同供体的间充质干细胞产生持续的和可重复的基因表达。外周血分离出间充质干细胞数量很低，很难诱导分化为软骨细胞9 。2.2 间充质干细胞的诱导在体外间充质干细胞需要诱导才能分化为软骨细胞。
9、这种诱导包括添加许多不同的生长因子，分化因子，激素和细胞因子。主要的有转化生长因子（TGF-3 1 TGF-3 3）胰岛素样生长因子（IGF-1）,地塞米松，骨形态发生蛋白家族（BMPs）等。在软骨细胞的软骨分化过程中涉及激活的一个主要的信号传导通路是裂原活化蛋白激酶（MAPKinase）通路，它能够刺激形成特异性的软骨形成转录因子 Sox9,在软骨细胞形成表型和功能方面起着重要作用。间充质干细胞向软骨细胞分化过程中的细胞内的作用机制目前不是很清楚。LouiseA 10研究在单层塑料或 3D胶原GAG支架中由TGF-3 1和IGF-1诱发的信号传导通路，信号传导通 路介导成体鼠来源的间充质干细
10、胞向软骨分化。结果表明在单层培养和在胶原GAG 支架中的TGF-3 1诱导的软骨分化中包括 p38途径，然而在单层培养中IGF-1诱导的软骨分化累及p38,ERK/2和P13K。在IGF-1处理的间充质干细胞的细胞核内发现在P13K下游区的Akt（苏氨酸激酶）磷酸化和磷酸-Akt 累积。表明不同生长因子诱导的间充质干细胞向软骨分化的信号传导通路不同，但同种生长因子在二、三维环境中刺激分化时细胞内的信号通路是相似的。加入TGF-3 1的诱导软骨分化可能通过 smad3和3蛋白（Bcatenin）,以及 Wnt信号通路来介 导，提高间充质干细胞的分化能力，同时抑制成脂肪和成骨11 。使细胞分化成为
11、软骨系必须上调 3-catenin ,然而对于成熟的成人软骨细胞，伊catenin能够刺激软骨细胞肥大和骨化。HansooParka等13研究一个可注射的生物可降解的水凝胶复合物聚L-醇延胡索酸（OPF）,包含兔骨髓间充质干细胞和明胶微粒，并带有TGF-3 lo生物鉴定法显示 DNA数量在各组间没有明显的不同，然而与对照组相比微粒组糖胺聚糖有明显的增加；软骨特异性n型胶原和蛋白聚糖基因的表达明显增加并与TGF-3 1浓度呈剂量依赖性改变。表明兔间充质干细胞在培养期是有活力的并分化为软骨样细胞。KeunHongPark等12将兔的间充质干细胞种植在混合的水凝胶中，加入TGF-3 3或基本的成纤维
12、细胞生长因子（bFGF）,判定生长因子对向软骨分化的效果。在含有TGF-3 3的水凝胶支架内， 检测全部的胶原和聚氨基葡糖含量最高，增殖率和产生软骨特异性的细胞外基质比bFGF组明显增高。这表明加有 TGF-3 3的细胞数量增加并保持细胞表型。A.H.Huang 等14确定负载软骨细胞和间充质干细胞的水凝胶构建物在化学培养基内培养加入TGF-3 3时，能否达到正常的组织的抗张力性质，细胞负载琼脂糖水凝胶构建物作分光 特性并在化学的无血清培养基内培养。细胞浓集且拉伸率提高并且保持在300400kPa的水平，最终的紧张度和韧性增加，通过免疫组织化学染色方法H型胶原沉积明显增加。动物实验已经显示TG
13、F-3 3能促进间充质干细胞向软骨分化21,23。LorenzU等15将人间充质干细胞种植在可控制的释放IGF-1丝纤蛋白（SF皮架内，将支架 放在含TGF-3 1补给性培养基内。在支架内第 2周发现人间充质干细胞的软骨分化，第 3周 最明显，在不负载的控制组支架内没有观察到软骨分化。表明 IGF-1在多孔SF支架内具有 刺激人间充质干细胞向软骨分化的潜能。地塞米松是一种合成的糖皮质激素，能够直接与糖皮质激素受体结合诱导软骨分化，是一种强有力的软骨分化的刺激物，并且能够加强TGF-3的作用16。BMPs属于TGF-3超家族，能诱导软骨形成，尤其是 BMP-717，BMP-2、TGF-3联合应用
14、 或者BMP-6和TGF-3联合应用能够促进软骨分化。然而单独使用BMP-2诱导成骨细胞形成17。BMP-2、TGF-3合用通过 Wnt信号传导通路上调 Wnt3a、3-catenin ,然后诱导产生 Sox9和软骨形成。HannaTaipaleenm ki等18通过抑制造血细胞生长，分离贴附的老鼠 来源的间充质干细胞，可以快速的去除CD34 CD45阳性表达细胞，以生产出短期选择 （STS）细胞。进一步传代更富集的、更原始的、均一的Scal表达的长期的选择（LTS抑胞。应用几种BMP诱导微球培养的间充质干细胞向软骨细胞分化。在STS细胞，软骨分化进展很快，在STSffl胞rhBMP2和7支持
15、快速的软骨分化和终末分化，强于 rhBMP6。在LTS细胞，rhBMP 同源二聚体-2,-4,-6,和rhBMP异源二聚体2/7是有效的软骨分化的强化因子，强于rhBMP5 ,7。2.3构建组织工程软骨间充质细胞已经与各种生物支架技术联合应用，在动物模型中显示了良好的软骨修复潜能。王文良等19以骨髓间充质干细胞为种子细胞，运用纤维蛋白胶种植技术，以双层壳聚糖（CS）/羟基磷灰石（HA）复合支架为载体，修复兔骨软骨缺损，结果显示基本修复软骨缺损， 骨缺损有骨小梁长入，改良 Wakitani评分优于对照组。$,|_柏口等20从11个新西兰大 鼠的后侧骼崎获取骨髓间充质干细胞，在自体血清中培养 28
16、d并在移植前24h转移至透明 质烷支架内。在双侧膝关节的内侧骨果制造4mm直径和1.5mm深的缺损，在一侧膝关节植入含有间充质干细胞的支架，对侧膝关节只植入支架。24周后处死兔子，组织学可以观察到缺损处高度的填充，两组间没有明显的不同，然而在间充质干细胞处理组有更好的修复质量 的趋势，没有形成肥大细胞。MrugalaD等21从绵羊骨髓中分离间充质干细胞，扩增，并鉴定，在后腿的骸骨内侧制造部分厚度的软骨缺损，将间充质干细胞种植在壳聚糖内填充软骨缺损，并加入 TGF-3 3在植入后2个月观察到修复部位透明样的软骨样基质包绕软骨 样的细胞，并于周围软骨整合在一起。BerndWegener等22在成年
17、羊的股骨牌负重部位制造关节软骨缺损（直彳至8mm）,应用微骨折术治疗（n=6）,聚糖酯乳酸植入物治疗 （n=6）或联 合两者治疗（n=6）。12周后处死动物，检测缺损由再生组织覆盖的程度和用O Driscol砰分检测再生的质量。结果显示联合治疗与单独使用微骨折术相比能够使再生物的质量明显提高。SeungHwanHan等23应用间充质干细胞/ PLGA聚乳糖酯酸复合物）支架，在移植前经过 TGF-3 3处理3周，然后把复合物移植到兔的股软骨缺损处。在移植12周后，12只兔子中的10只显示间充质干细胞/PLGA支架复合物显示软骨再生。组织学检查为透明样的结构，表达糖胺聚糖和2型胶原。在统计学上组织
18、学评分与正常的关节软骨相同，表明使用间充质干细胞/PLGA支架复合物并加入 TGF-3 3能够成功的再生关节软骨，治疗软骨缺损。 2.4间充质干细胞在临床实验中应用 应用间充质干细胞治疗人关节软骨缺损的临床实验很少。WakitaniS等24对24例骨性关节炎病人进行临床实验。 在这项研究中24个病人均接受胫骨高位截骨术，从12个病人的骨髓获取自体间充质干细胞，在单层培养中扩增并种植在I型胶原膜上，植入软骨缺损部位， 12个病人作为对照组，接受不带间充质干细胞的植入物。在移植后 42周，缺损部位由白色 软组织覆盖，在样本组织的几乎所有部位观察到甲苯胺蓝染色，局部观察到透明软骨样组织形成。虽然临床症状好转没有明显的不同，细胞移植治疗组与对照组相比，关节镜和组织学等级评分更高。 WakitaniS等25获取病人自体骨髓间充质干细胞，体外自体血清培养扩增， 将其种植在胶原凝胶内植入缺损部位，修复经关节镜证实的3 个病人的髌股关节软骨全层缺损，并用自体骨膜或t膜覆盖，在移植后6个月病人的症状明显改善，并且保持1727个月。KurodaR等26将自体间充质干细胞种植在胶原支架内，修复运动员的右膝内侧股骨髁的全层软骨缺损，植入物用自体的骨膜瓣覆盖，结果显示术后1 年病人的临床症状明显改善，恢复到先前的运动水平，没有疼痛和其他合并症。以上表明自体骨髓间充质干细胞移植是促进软骨缺损修复的有效方法。