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1、病毒与细胞相互作用,1,第四章 病毒与细胞间的相互作用,第一节 病毒的培养第二节 病毒与细胞的相互作用,病毒与细胞相互作用,2,第一节 病毒的培养,病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。,病毒与细胞相互作用,3,动物接种：,接种后通常以动物发病、死亡作为感染的指标。,按病毒侵袭部位不同选择适当的接种途径。嗜神经病毒接种在小鼠的脑内。痘苗病毒和单纯疱疹病毒接种于家兔角膜。,鸡胚接种：,一种比较经济简便的方法。,一般采用孵化9-12天的鸡胚，按病毒种类不同接种于鸡胚的不同部位。,病毒与细胞相互
2、作用,4,可采用绒毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔接种。,病毒与细胞相互作用,5,人或动物细胞在一定条件下可在实验室的培养瓶内生长。 优点：每个细胞生理特性基本一致，对病毒易感性相等无个体差异，准确性和重复性好可严格执行无菌操作细胞培养本身就能显示病毒的生长特征应用空斑技术可进行病毒的克隆化,细胞培养,病毒与细胞相互作用,6,原代细胞（primary cell） 动物组织经胰蛋白酶消化处理，使细胞分散而得到的细胞。二倍体细胞株（diploid cell strain） 将长成单层的原代细胞消化分散成单个细胞，继续培养传代，其染色体数与原代细胞一样，保持其二倍染色体数目的细胞，称为二倍体细胞。传代细胞系
3、（established cell line）能在体外持续增殖传代的细胞，大多数由癌细胞或二倍体细胞突变而成。,（一）细胞的类型,病毒与细胞相互作用,7,（二）细胞培养的方法,静置培养（stationary culture） 实验室常用。细胞悬液装瓶，5%CO2温箱静置培养，细胞沉降并贴附在玻面上生长分裂，最后长成单层。旋转培养（roller culture） 大规模生产疫苗。细胞在玻瓶内生长时，玻瓶不断缓慢旋转，细胞帖附于玻瓶四周，长成单层。,病毒与细胞相互作用,8,悬浮培养（suspensive culture） 通过搅拌使细胞处于悬浮状态，并补充营养和校正pH，使之生长或维持存活。微载体
4、培养（micro-carrier culture） 是在悬浮培养的基础上，结合微载体的细胞培养技术。 微载体是直径10035m的微小颗粒，对细胞无毒性，细胞可贴附其上长成单层。,病毒与细胞相互作用,9,第二节 病毒与细胞的相互作用,杀细胞感染非杀细胞感染 引致持续感染，对细胞代谢无影响。产生干扰素,生产性感染（productive），病毒感染后能产生和释放子代病毒颗粒。宿主细胞感染病毒发生的变化可能是细胞死亡或细胞转化非生产性感染（nonproductive）或称顿挫感染（abortive infection） 病毒感染后不形成完整的病毒颗粒持续性感染（persistent infection
5、）是指持续长时间的感染，感染过程中不形成感染性的病毒颗粒,病毒与细胞相互作用,11,病毒与细胞的相互作用,病毒与细胞相互作用,12,一、病毒引致的杀细胞变化,细胞病变效应(cytopathic effect,CPE) 由病毒感染导致的细胞损伤。CPE能在光学显微镜下观察。常见的细胞形态学变化为细胞变圆、坏死、溶解、脱落或形成合胞体。有些病毒能形成包涵体。,病毒与细胞相互作用,13,细胞肿大 细胞圆缩 形成合胞体病毒所致的细胞病变,病毒与细胞相互作用,14,tissue culture cells,epithelial,epithelioid,fibroblastic,病毒与细胞相互作用,15,
6、epithelial cells,uninfected,early infection,late infection,slides from CDC,病毒与细胞相互作用,16,fibroblastic cells,uninfected,early infection,late infection,slides from CDC,病毒与细胞相互作用,17,Formation of multinucleated cells.,病毒与细胞相互作用,18,能够使半数组织细胞在一定条件下发生细胞病变的病毒量。用于判定病毒的毒力。,半数组织细胞感染量（tissue culture infectious d
7、ose 50, TCID50）,病毒与细胞相互作用,19,涉及细胞膜的CPE 有囊膜的病毒出芽过程中能将其融合蛋白直接插入宿主细胞膜，结果导致膜融合以及合胞体（syncytia）形成。 慢病毒、副粘病毒、麻疹病毒、肺病毒、某些疱疹病毒等感染 涉及细胞骨架的CPE 微丝（如actin）、中介丝（如vimentin）及微管（如tubulin）等细胞骨架与细胞结构的完整性、物质运输及运动性等有关。,病毒与细胞相互作用,20,病毒引致的细胞凋亡与坏死 坏死（necrosis）、 凋亡（apoptosis）,图2432-2 感染犬瘟热病毒凋亡的Vero细胞的电镜照片,病毒与细胞相互作用,21,病毒感染抗
8、体依赖的增强作用（Antibody-dependent enhancement of viral infection, ADE） 在病毒感染过程中，宿主产生的抗体与病毒结合，非但未能阻断病毒吸附宿主细胞，反而增强了病毒对细胞的感染，提高了病毒的滴度。,病毒与细胞相互作用,22,（一）空斑试验,将适当浓度的病毒悬液加入单层细胞培养中，当病毒吸附细胞后，再覆盖一层融化的琼脂。病毒在细胞内复制后产生局限性病灶，病灶逐渐扩大，肉眼也能看见，此即空斑(plaque)。,病毒与细胞相互作用,23,病毒与细胞相互作用,24,空斑是由一个感染性病毒粒子复制形成的，类似于细菌的菌落，称为空斑形成单位（PFU）。
9、病毒悬液中的感染性病毒量以每毫升含有的PFU来表示。,病毒与细胞相互作用,25,空斑试验的用途：,1. 测定病毒数量2. 纯化病毒 单个空斑作悬液，梯度稀释后再作空斑，可获得病毒克隆。3. 鉴定病毒 不同病毒的空斑具有不同的特征。,病毒与细胞相互作用,26,（二）包涵体（inclusion body),定义：是某些病毒感染细胞产生的特征性的形态变化，在普通光学显微镜下可见胞浆或胞核内出现的呈嗜酸性或嗜碱性染色、大小数量不等的圆形或不规则形的团块状结构，称为包涵体。,病毒与细胞相互作用,27,图324-4 疱疹病毒的包涵体,病毒与细胞相互作用,28,包涵体的性质,病毒成分的蓄积，如狂犬病毒的Ne
10、gri氏体大量晶格样排列的病毒颗粒组成，如腺病毒的包涵体细胞变性的产物，不含病毒，如疱疹病毒的包涵体,病毒与细胞相互作用,29,定义：由病毒或诱生剂刺激机体细胞产生的具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的糖蛋白。 种类：、干扰素。抗病毒作用：干扰素不直接作用于病毒，而是作用于邻近的细胞，使其产生抗病毒蛋白，这些抗病毒蛋白降解病毒mRNA、抑制蛋白合成。干扰素作用具有宿主特异性，而无病毒特异性。,二、干扰素（IFN）,病毒与细胞相互作用,30,病毒与细胞相互作用,31,干扰素抗病毒机制,病毒与细胞相互作用,32,RNA干扰（RNA interference, RNAi）指细胞利用内源或外源的小分子双
11、股RNA片段，特异性地降解同源基因的mRNA，从而导致靶基因转录后的基因沉默（post translational gene silence, PTGS）的现象。,病毒与细胞相互作用,33,复习思考题,1. 细胞培养有何优点？2. 原代细胞、二倍体细胞和传代细胞系的概念。3. CPE、PFU、空斑、包涵体和干扰素的概念。,病毒与细胞相互作用,34,第五章 病毒的致病机理,病毒与细胞相互作用,35,病毒的持续性感染 类型,持续性感染（persistent infections） 不论是否发病，感染性病毒始终存在。 潜伏感染（latent infections） 又名隐性感染。除非激活，一般并不能发现感染性病毒颗粒。 长程感染（slow infections） 具有感染性的病毒在一个很长的临床前阶段逐渐增多，最终导致缓慢的、渐进性致死疾病。 迟发性临床症状的急性感染（acute infection with late clinical manifestiations） 此类病毒的持续性复制与疾病的进程无关。,病毒与细胞相互作用,36,