最新第三章 细胞工程-PPT文档.ppt

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1、1.细胞工程(cell engineering)的基本原理 细胞是构成生物体的基本单元。 细胞本身、细胞代谢的中间产物或最终产物具有十分重要的用途，如医药产品，诊断试剂，生物催化剂及各种精细化学品等。 细胞工程：就是通过大规模的细胞或组织培养，获得所需要的产品的技术。,细胞细胞工程操作的对象。,1.1细胞工程的基本原理,细胞的全能性是指已经分化的细胞在合适条件下具有潜在的发育成完整植株或个体的能力。,全能性这个概念在20世纪70年代，已经在植物细胞上完全得到证实和发展。 对微生物而言，一个微生物细胞就是一个生命，在合适条件下，可以形成一个单菌落，并且具有自我复制、新陈代谢等生命基本特征。,细胞

2、的全能性是细胞工程学科领域的理论核心。,干细胞的研究成果（干细胞的发现）否定了动物细胞不具有全能性的传统观念。,同食品工业密切相关的是离体细胞的培养及次生代谢产物的产生。,细胞全能性的概念在20世纪80年代之后又进一步发展，细胞不仅具有发育成完整植株和个体的潜能，而且具有在细胞水平上表达出有用次生代谢物等多方面的能力。,细胞具有全能性是由于每个细胞都有一套完整的基因组。,百合愈伤组织分化,1.2细胞工程的基本操作 细胞工程的基本操作有：无菌操作技术、细胞培养技术、细胞融合技术。,无菌操作技术 细胞工程的所有实验都要求在无菌条件下进行。 实验操作应在无菌室内进行。,超净工作台是最基本的实验设备，

3、一切操作都应在超净工作台上进行。,其次，对生物材料、实验所用的一切器械、器皿、药品等都应进行灭菌或除菌。,细胞培养技术 细胞培养是指动物、植物和微生物细胞在体外无菌条件下的保存和生长。,最后，将生物材料接种于培养基中后，放入适当的培养条件下进行培养。,细胞培养： 首先，要取材和除菌；,其次，根据各类细胞的特点，配制相应的培养基进行灭菌；,细胞融合技术 细胞融合：两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并，染色体等遗传物质重组的过程。,细胞融合是细胞工程的重要技术，主要过程包括：,a：原生质体制备；,b：诱导细胞融合；,c：筛选杂合细胞等过程。,2.细胞培养技术,细胞培养包括微

4、生物细胞培养、动物细胞培养 和植物细胞培养。,通过细胞培养可以得到大量的细胞或其代谢物，如单细胞蛋白（SCP）、抗生素、氨基酸、酶制剂、疫苗等，具有广泛的用途。,2.1微生物细胞培养 2.2动物细胞培养,自学,2.3植物细胞培养 2.3.1植物细胞培养基的组成及种类,培养基组成：,无机盐 无机盐主要有K+、NH4+、Ca2+、Mg2+、P、S等，微量元素包括B、Mn、Zn、Mo、Cu、Co和Fe等。,碳源 一般以蔗糖或葡萄糖糖为碳源 ，果糖和麦芽糖的利用效果差一些。 通常增加培养基中的蔗糖含量，可增加培养细胞的次生代谢产物量。,有机氮源 通常采用的有机氮源有蛋白质水解物，谷氨酰胺或氨基酸的混合

5、物。 有机氮源对细胞初期培养的早期生长阶段有利。,植物生长激素,维生素 植物细胞培养需要加入硫胺素，如果加入烟酸、吡哆醇、泛酸、生物素等效果更好。,复合物质 复合物质通常作为细胞的生长调节剂，有酵母抽提液、麦芽抽提液、水果汁等。,2.3.2植物细胞培养方法 植物细胞培养方法多种多样，悬浮细胞培养是生产中应用最多的一种培养方法。,下面重点讲述植物细胞悬浮培养。,悬浮细胞培养概念 指将组织培养物分离成单细胞，悬浮在液体培养基上进行培养的方法。,植物细胞培养的基本操作过程,整体植株植物组织或器官外植体在固体培养基上诱发愈伤组织愈伤组织继代培养悬浮培养,a：植物组织培养 指在无菌条件下，将离体的植物器

6、官（如根尖、茎尖、叶、花、未成熟果实、种子等）、组织（如花药组织、胚乳、皮层等）、细胞（体细胞、生殖细胞等）、胚胎（如成熟胚胎和未成熟胚胎）、原生质体等培养在人工配置的培养基上，给予适当的培养条件，诱发产生愈伤组织、潜伏芽或长成新的完整植株的一种技术。 植物细胞培养是组织培养的技术之一。,几个重要概念,b:外植体 指植物组织培养中用来进行离体无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。,c:愈伤组织 指外植体组织增生的细胞产生的一团不定型的疏松排列的薄壁细胞。,d:继代培养 指愈伤组织在培养基上生长一段时间后，营养枯竭，水分散失，并已积累了一些代谢产物，此时需要将这些组织转移到新的

7、培养基上，这种转移称为继代培养或传代培养。,胡萝卜的愈伤组织,当归愈伤组织及组织分化,香茶菜愈伤组织及分化苗,植物细胞悬浮培养的要求,b:悬浮培养条件 通常采用水平振荡，振幅24cm为宜；温度2430为宜；在培养过程中需连续不断的供氧，使氧溶解量维持在一定的水平；大多数植物细胞培养pH为57；细胞起始密度一般为0.52.5105个/m l。,a:选择合适的培养材料 一般选用疏松易碎的愈伤组织进行起始悬浮培养。 另一种材料是取自植物的茎部组织或幼胚，将其组织破碎后利用破碎组织进行液体悬浮振荡培养。,c:剪切力对细胞悬浮培养的影响 植物细胞对剪切力敏感。剪切力对植物细胞的影响主要表现在两方面：一、

8、积极影响。 二、负面影响。,d:防止细胞凝聚成块 植物细胞很少以单一细胞悬浮生长，具有聚集在一起的特性，容易积聚成细胞团。,e:保持细胞培养无菌 植物细胞培养基成分复杂而且丰富，适合微生物生物生长，极易造成污染。 植物细胞生长速度慢，操作周期长。,a:分批培养法 指在新鲜的培养基中加入少量的细胞，在培养过程中既不从培养系统中放出培养液，也不从外界向培养系统中补加培养基的一种培养细胞的方法。,分批培养操作简便，广泛应用于实验室和生产中。,特征：培养基的基质浓度是随培养时间的增加而下降，细胞浓度和产物随培养时间的增加而增加。 细胞经历诱导期、对数期、稳定期和衰亡期。,b:半连续培养法 指在反应器中

9、投料和接种培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培养液进行交换的培养方法。,特征 ：可不断补充培养液中的营养成分，减少接种次数，使培养细胞所处环境与分批培养一样随时间而变化。,工业生产中为简化操作过程，确保细胞增殖量，常采用半连续培养法。,c:连续培养法 指在培养过程中，不断抽取悬浮培养物并注入等量新鲜培养基，使培养物不断得到养分补充和保持其恒定体积的培养方法。,特征： 一、由于不断的加入新鲜培养基，保证了养分的充分供应，不会出现悬浮培养物发生营养不良的现象； 二、连续培养可在培养期间，使细胞长久的保持在对数期，细胞增殖速率快； 三、连续培养适合于大规模工业化生产。,2.3.3植物细胞培养生物反应

10、器,20世纪70年代，开始研究植物细胞大规模培养，主要借助微生物培养时广泛应用的搅拌式生物反应器。,植物细胞培养生物反应器必须最大限度的发挥植物细胞合成次生代谢产物的潜力。,随后，剪切力较小的鼓泡柱反应器和气升式反应器得到人们的青睐。,植物细胞培养中也出现了微生物发酵中不常见的转鼓式反应器和膜生物反应器等。,以上几种用于植物细胞培养的反应器及其应用如下：,反应器类型 植物细胞体系 搅拌式反应器 长春花、胡萝卜、毛地黄、烟草等 鼓泡柱反应器 大豆、烟草等 气生式反应器 长春花、雷公藤等 膜生物反应器 烟草、长春花、人参细胞等 转鼓式反应器 紫草等,目前，鼓泡床反应器和气升式反应器最常用于植物细胞

11、培养。,鼓泡床反应器：是微生物好氧发酵采用的最简单反应器之一。优点：密封性好，剪切力小，易放大。 缺点：反应器内部的液体流型不稳定。,气升式反应器：空气在导流管中与培养基混合，既为植物细胞的生长提供了必需的氧气和良好的混合，流体的剪切力又比较适合植物细胞生长和代谢，而且没有机械传动。 在植物细胞培养中得到广泛应用 。,膜生物反应器,气升式反应器,鼓泡反应器,5L 光照植物细胞培养罐,40吨 植物细胞培养罐（紫杉醇细胞）,3、动物细胞培养,动物细胞培养是指离散的动物细胞在体外人工无菌条件下的生长增殖，在整个过程中细胞不出现分化，不再形成组织。,培养的细胞类型：悬浮型和贴附型 常用培养基： 天然培

12、养基 如血清。 合成培养基 如eagle基本培养基、DMEM等。需加一定比例的天然成分，最普通的是加入血清。 无血清培养基。,原代培养培养的动物细胞大都取自动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，将组织取出来后，先用胰蛋白酶等使组织分散成单个细胞，然后配制成一定浓度的细胞悬浮液，再将该悬浮液放入培养瓶中，在培养箱中培养，这个过程称为原代培养。 传代培养细胞在培养瓶中贴壁生长。随着细胞的生长和增殖，培养瓶中的细胞越来越多，需要定期地用胰蛋白酶使细胞从瓶壁上脱离下来，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中培养，这称为传代培养,培养方法： 悬浮培养、 帖壁培养、 固定化培养、 大规模培养

13、法。,大规模培养技术是在帖壁培养和悬浮培养的基础上，融合了固定化细胞、流式细胞术、生物反应罐技术等发展起来的。 空心纤维法 微载体法 微囊法,动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。用胰蛋白酶分散细胞。动物细胞培养适宜的pH为7.27.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶（7.2-8.4）的活性较高。,胰蛋白酶,当继续传代培养时，少部分细胞会克服细胞寿命的极限，获得不死性，这些细胞已经发生了突变，正在朝着同等于癌细胞的方向发展。,左图显示了创面愈合过程中一个十分有趣的现象。当周边的上皮向创面中央爬行时,一旦上皮细胞互相接触

14、,就停止分化和增殖。该现象就叫“接触抑制”。因此,创面上不会出现多余的皮赘。这是一种十分巧妙和“神秘”的调控现象。,细胞的接触抑制,细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，数量不断增加，最后形成一个单层，此时细胞间相互接触，细胞分裂和生长停止，数量不再增加。,细胞的接触抑制,CO2细胞培养箱,万级洁净细胞培养室,细胞培养瓶,细胞培养瓶,细胞培养,4.细胞融合技术 细胞融合：又称细胞杂交，是指将不同来源的原生质体（除去细胞壁的细胞）相融合，并使之分化、再生、形成新物种或新品种的技术。 或简单定义为将两个或多个细胞融合在一个细胞的过程。,细胞融合技术是20世纪60年代发展起来的一项细胞工程技术。 细胞

15、融合这种生物现象最初是在动物细胞中发现的。现已证明其可以在种间、属间、科间甚至动物与植物间发生，其范围包括动物、植物和微生物。,细胞融合技术不但在基础研究（如核质相互关系、基因的作用和定位等）方面有重要作用，而且在动植物的改良、微生物育种、疾病诊治等方面都有良好的发展前景，已经成为细胞工程中的核心技术。,3.1细胞融合的方法及其作用机理,3.1.1生物学法 主要采用病毒促进细胞融合。 许多病毒，如仙台病毒、疱疹病毒、天花病毒、副流感型病毒、一些致癌病毒均能诱导细胞融合，其中仙台病毒（HVJ)是最早应用于动物细胞融合的融合剂。,采用灭活病毒促进细胞融合,仙台病毒，也称日本血凝病毒，属粘液病毒副流

16、感类群，多型颗粒状，RNA病毒，易在小鼠中蔓延。其毒力低，对人危害小，而且易被紫外线等灭活，是生物学方法中最常用的细胞融合剂。,病毒可以用作融合剂机理： 许多病毒都具有凝集细胞并使凝集细胞发生融合的能力。 许多病毒（如仙台病毒）还具有促进凝集细胞发生融合的能力（因为各种能被其作用的细胞均具有相应受体位点的原因）。,现已知道病毒促进融合的有效部位在细胞膜上。,4.1.2化学融合剂法,化学融合剂主要包括：PEG、二甲亚砜、甘油醋酸酯等，在Ca2+存在下皆可促进细胞融合。 其中，PEG的应用更为广泛。,PEG，聚乙二醇，是一种多聚化合物，表面活性剂，其活性稳定，使用方便。同时，促进细胞融合的能力较强

17、。 PEG与水分子以氢键结合，使自由水消失，导致高度脱水的原生质体凝集融合，融合时必须有Ca2+参与。,4.1.3电处理融合法,电融合法是20世纪80年代出现的细胞融合技术。 当细胞处于电场中，细胞壁两面产生电势，其数值与外加电场的强度以及细胞的半径成正比。由于细胞膜两面相对电荷正负相吸，使细胞膜变薄，随着外加电场强度升高，膜电场增强，当膜电势增强到临界电势时，细胞膜处于临界膜厚度，导致发生局部不稳定和降解，从而形成微孔，进而质膜开始连接，直到闭合，完成融合。,优点：如融合率高；重复性强；对原生质体伤害小；可在显微镜下观察或录像融合过程；免去PEG诱导后的洗涤过程；诱导过程可控性强等。,4.2

18、细胞融合技术 以微生物细胞为例，讲述细胞融合的方法和过程。,4.2.1微生物原生质体的制备 要制备微生物的原生质体，必须有效的除去细胞壁。,细菌： 细胞壁的主要成分是肽聚糖。 一般G+菌易被溶菌酶消化除壁； G细胞壁成分及结构较复杂，必须采用溶菌酶和EDTA一起处理。 一般溶菌酶用量为1001000U /ml。,各类微生物细胞壁结构和组成不同，需采用不同方法脱壁。,放线菌： 是一类形态及分化特征较独特的微生物，分类上属于G+，细胞壁结构类似于其它G+（肽聚糖为主），一般放线菌常用溶菌酶处理。,真菌： 细胞壁成分主要是纤维素，几丁质和葡聚糖等。 酵母菌常用蜗牛酶和酵母裂解酶； 青霉、曲霉多用纤维

19、素酶和糖苷酶等处理（青霉用-1，3糖苷酶，曲霉用-1，3糖苷酶和-1，4糖苷酶）。 有的丝状真菌还需添加蜗牛酶、壳聚糖酶等配合使用。,原生质体,原生质体制备之前，微生物细胞需经过种子培养，振荡培养到对数期为宜。 一般而言，对数生长期的菌体容易被相应的酶酶解脱壁，原生质体的生成率最高。 其他时期原生质体的生成量会有比较大的不同，特别是稳定期，其得率会急剧下降。,原生质体形成以后，就必须使其处于一个适当渗透压的环境中，这样才能免于破裂。,原生质体对渗透压敏感，因此，在琼脂平板上涂布培养后其会在低渗条件下破裂失活，不能形成菌落，菌落越少，说明原生质体化效果越好。,原生质体形成率=原生质体数/未经酶处

20、理的总菌数,3.2.2微生物原生质体融合,融合：就是把两个或多个亲本的原生质体混合起来，使其形成融合子的过程。,最常用的融合方法是PEG融合和电融合。,以PEG为例说明融合过程： 作好两种原生质体的识别标记，如色素、缺陷型、抗性标记等。 原生质体的密度为105个/ml左右，两种原生质体按照11等量混合，离心去除上清液，沉渣置于高渗稳定液中，加40%PEG，用滴管轻轻吹打，使细胞分散均匀。 适当温度水浴保温一定时间，稀释。 取少量最后稀释液涂布到高渗再生平板上，培养。 检查,4.2.3微生物原生质体的再生 原生质体再生：使原生质体重新生长出细胞壁，回复到完整的细胞形态的过程。,原生质体再生是使用

21、原生质体融合进行育种的一个必要环节，如果原生质体化后不能再生，不能生成完整的细胞，则就失去了意义。,原生质体再生的条件较为严格，而且不同的微生物又有所不同。 共同点需要高渗环境。,原生质体能再生细胞壁，回复到细胞形态的总只是其中的一部分。 为了得到较高的再生率： a:在试验过程中，操作条件温和，避免因为机械力量引起原生质体破碎； b:再生用平板培养基在涂布前，应先除去培养基表面多余的冷凝水； c:原生质体的再生活性和制备中的一些条件密切相关，如菌龄、酶的用量、酶作用时间等； d:原生质体再生培养阶段外加某些物质可以提高原生质体的再生率，一般是加入细胞壁合成的引物。,4.2.4微生物融合子的筛选

22、,融合子：原生质体融合后，来自两亲本的遗传物质经过交换并发生重组而形成的子代细胞。,融合后获得的仅仅是融合子，还需要对它们进行生理生化测定及生产性能的测定，以确定是否符合育种要求。,3.3微生物原生质体融合的优点 有较高的诱变率 去除了细胞壁的障碍，诱变效率比较高，特别是对一些本来对诱变剂作用不敏感的微生物。 重组子类型多 原生质体融合后，两个亲株的整套基因相互接触，可以有充分的机会发生多次交换，产生各种各样的基因组合而得到多种类型的重组子，而且参与融合的亲株数不限于两个，可以是三个、四个等。,有较高的融合率 借助各种方法，可以得到较高的融合率。 可以与多种育种方法结合使用 与较高的筛选率 可

23、以用温度、药物和紫外线照射等处理钝化亲株的一方或双方，然后再使之融合，这样可以在筛选中除去某一亲株一方的不良性状，提高筛选效率。,5.固定化细胞技术 5.1细胞固定化的定义和意义 细胞固定化：是指将游离的细胞包埋在多糖或多聚化合物制备成的网状支持物中，培养液呈流动状态进行无菌培养的一门技术。,固定化技术最早在酶工程中得到应用。 酶具有催化反应专一性强、催化效率高、反应条件温和等优点。但实际生产中，由于其价格昂贵，传统分批式操作使得有活性酶的回收比较困难，而且在有些有机溶剂及高温条件下使用时，酶极易失活，酶固定化技术应运而生。,细胞固定化培养技术是一项新型的细胞培养技术，尤其适合于细胞培养生产活

24、性代谢产物。 与悬浮游离细胞相比较，植物细胞固定化培养具有以下优点： 固定化细胞生长速度较游离细胞缓慢，有利于次生代谢产物的积累。 易于控制环境，收获次生代谢产物。 细胞经包埋后使其所受的剪切力损伤减小。 易获得高密度细胞群体。 有利于进行连续培养和生物转化。,5.2完整细胞固定化方法,主要有：吸附法、包埋法、交联法和共价法。,经常用到的固定剂主要是一些多糖和多聚化合物等，如海藻酸钠、卡拉胶、琼脂、琼脂糖、角叉藻聚糖、明胶、聚丙烯酰胺等。,下面重点以海藻酸钠作为固定剂介绍细胞的固定化方法。,海藻酸盐与Ca2+交联是完整细胞包埋技术中的一种常用方法。,海藻酸盐是一种由古洛糖醛酸和甘露糖醛酸组成的

25、多糖，在Ca2+等多价阳离子的存在下，糖中的羧基和阳离子之间形成离子键，从而形成胶体颗粒。 如果采用磷酸、柠檬酸、EDTA等离子复合剂处理，又能使胶体颗粒溶解释放出细胞。,大规模固定化的步骤基本与上述相同，不同的是采用专门的固定化装置进行固定化。示意图如图：,工作原理：通过鼓入无菌空气将海藻酸钠溶液和细胞悬液喷入含有Ca2+的培养基中。,6.细胞工程在食品产业中的应用 6.1植物细胞培养技术的应用 植物细胞工业规模化培养首先是细胞生物量的增长。如人参细胞培养规模已达2m3，我国也达到日产10kg的湿细胞产量。收集湿细胞，冻干，得到活性人参细胞粉，既是保健食品的原料，亦可作为药材。其中除含人参皂

26、甙外，尚含有酶类及其他活性成分，其保健作用优于天然人参。,西洋参细胞培养工艺举例： 西洋参属五加科，人参属植物，为名贵的中药材之一，其所含的主要有效成分为皂甙，目前尚不能人工合成。,工艺流程,悬浮培养,悬浮细胞培养物,大量培养,发酵液,过滤,细胞,干燥,西洋参细胞干粉成品,过滤,细胞,干燥,过滤,细胞,干燥,悬浮细胞培养物,大量培养,发酵液,西洋参细胞干粉成品,细胞,干燥,无菌根,诱导培养,愈伤组织,悬浮培养,发酵液,悬浮细胞培养物,大量培养,悬浮培养,西洋参细胞干粉成品,干燥,发酵液,悬浮细胞培养物,大量培养,悬浮培养,悬浮细胞培养物,大量培养,悬浮培养,利用植物细胞工程生产香料,利用植物细

27、胞大规模培养技术已经能生产多种香料物质。 例如，在洋葱细胞培养中，从蒜碱酶抑制剂羟基胺中提取出了香料物质的前体烷基半胱氨酸磺胺化合物。 在玫瑰的细胞培养中发现增加成熟的不分裂细胞能产生除五倍子酸、表儿茶、儿茶酸等之外的更多的酚。,6.2原生质体融合技术在食品产业中的应用 原生质体融合已经成为微生物育种的重要手段，它的最大特点就是超越了生物体所具有的性的障碍，给育种和细胞间的融合提供了理论上的可能性。,乳糖发酵短杆菌和黄色短杆菌是两种重要的氨基酸产生菌。黄色短杆菌是赖氨酸高产菌株，但生长缓慢，发酵周期长，生产中容易染菌。将它与生长快的乳糖发酵短杆菌融合，得到了新的赖氨酸生产菌，提高了对葡萄糖的转

28、化率，发酵周期缩短了11%。,对于酱油酿造来说，曲霉所产生的各种酶的作用是十分重要的。如曲霉的蛋白酶对产率以及谷酰胺酶对酱油香味成分之一的谷氨酸的产量的影响都是很大的。过去在改良和培育酱油曲霉菌种时，其主要目的是增加产酶能力，但由于产蛋白酶的菌株产谷酰胺酶的能力低，而产谷酰胺酶高的菌株产蛋白酶能力低。把高产谷酰胺酶和蛋白酶的两亲株菌的原生质体融合，就可以获得双高的优良菌种。,细胞融合抗盐碱小麦,6.3固定化细胞技术在食品产业中的应用,固定化细胞应用于柠檬酸的生产。 黑曲霉和酵母菌固定化后，皆可用于柠檬酸发酵。 Horissu .H等人研究了聚丙烯酰胺凝胶包埋固定化黑曲霉生产柠檬酸，结果表明：与

29、同样游离细胞相比，固定化黑曲霉生产柠檬酸的产率提高了2.4倍。 Eikmeier等人用海藻酸钠固定黑曲霉分生孢子，经过预培养后，生产柠檬酸，结果表明：培养24d后，柠檬酸浓度达20g/L；在气升式反应器中，培养25d，柠檬酸浓度达45g/L，为摇瓶的2倍多。,Fsay. S.S等人用海藻酸钠固定黑曲霉分生孢子生产柠檬酸，结果表明：间歇发酵时，固定化细胞比游离细胞产生的柠檬酸要少；分批发酵时，固定化细胞使用4批次后，柠檬酸产量达70g/L以上，而游离细胞使用2批次后，柠檬酸产量迅速下降。因此，分批发酵时固定化细胞明显优于游离细胞。,采用固定化细胞技术为连续发酵生产柠檬酸以及其他发酵生产提供了一条有效途径，解决了丝状真菌在连续发酵中的培养难问题。,复习题 1：名词解释 细胞工程 细胞的全能性 植物细胞培养 外植体 愈伤组织 细胞融合 融合子 原生质体再生 细胞固定化,2.简答题 a.细胞工程的基本操作有哪些？并对其加以简要说明。 b.简述植物细胞培养时培养基的组成及其作用。 c.简述植物细胞悬浮培养的要求。 d.简述细胞融合的方法及其作用机理。,e.比较微生物细胞与植物细胞原生质体制备过程的异同点。 f.常用的细胞固定化方法有哪些？并试举一例对其加以简要说明。 3.论述题：微生物细胞原生质体融合技术及其在食品产业中的应用。,