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1、一、 培养基的基本要求,营养成分 促生长因子 激素 渗透压 pH 无毒、无污染,一、 培养基的基本要求,1、营养成分 氨基酸：氨基酸是细胞合成蛋白质的原料。所以细胞都需要12种必须氨基酸（缬、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、络、精、胱）。此外还需要谷氨酰胺，他在细胞代谢过程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶合成的来源，同样也是合成三、二、一磷酸酰苷所需要的基本物质。 单糖：培养中的细胞可以进行有氧与无氧酵解，六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。细胞对葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。,维生素：主要是辅酶、辅基，必不可少。生物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇
2、、核黄素、硫胺素、维生素B12都是培养基常有的成分。 无机离子与微量元素：细胞生长除需要钠、钾、钙、镁、氮、磷等基本元素，还需要微量元素，如铁、锌、铜、锰、钼、钒等。,2、促生长因子及激素,各种激素、生长因子的功能 维持细胞的功能 保持细胞的状态（分化或未分化） 有些激素对许多细胞生长有促生长作用，如胰岛素，它能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸。 有些激素对某一类细胞有明显促进作用，如氢化可的松可促进表皮细胞的生长，泌乳素有促进乳腺上皮细胞生长作用等。,3、渗透压,细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性。 人血浆渗透压290mOsm/kg，可视为培养人体细胞的理想渗透压。 鼠细
3、胞渗透压在320mOsm/kg左右。 大多数哺乳动物细胞，渗透压在260- 320mOsm/kg的范围都适宜。,4、pH,大多数细胞适宜pH为7.2-7.4 培养基应具备一定的缓冲能力 造成pH波动主要是代谢产生的CO2，在封闭式培养过程中CO2与水结合产生碳酸，培养基pH很快下降。 为解决这一问题，合成培养基中使用了NaHCO3- CO2缓冲系统，通过稳定调节温箱中CO2浓度（5%），使之与培养基中的NaHCO3处于平衡状态。,5、无毒、无污染,体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有任何抵抗能力，因此培养基应达到： 无化学物质污染 无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等） 无对细胞
4、产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体） 对于天然培养基，污染主要来源于取材过程及生物材料本身，应当严格选材，严格操作。 对于合成培养基，污染主要来源于配制过程，配制所用的水，器皿应十分洁净，配制后应严格过滤除菌。,二、天然培养基,天然培养基： 血清的种类 血清的主要成分和作用 血清的质量标准 血清的外观 血清的使用与储存 使用血清的优缺点,天然培养基：指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基。如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。 但是由于天然培养基制作过程复杂、批间差异大，因此逐渐为合成培养基所替代。 目前广泛使用的培养基是血清，另外各种组织提取液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某
5、些特殊细胞液是必不可少的。,血清的种类： 小牛血清 取自出生10-30天的小牛 新牛血清 取自出生24小时之内的新生 胎牛血清 取自剖腹产的胎牛，血清中 所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。,血清的主要成分和作用,主要成分 血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的，血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等。 主要作用 提供基本营养物质 提供激素和各种生长因子 提供结合蛋白 对培养中的细胞起到某些保护作用,血清的质量标准,血清质量高低取决于两方面因素：一是取材对象，二是取材过程。 理化性质： 渗透压、pH值、蛋白电泳图谱、蛋白 含量、激素水平、内毒素等。 蛋白含量包括
6、血清总蛋白含量（不低于35-45g/L）、球蛋白含量（应小于20g/L）、血红蛋白含量等。其中球蛋白含量是一项非常重要的指标，血清中球蛋白主要是抗体，球蛋白含量越低血清质量越高。血红蛋白也是越低越好。,微生物检测,包括细菌、真菌、支原体、病毒等。特别是对支原体、病毒的检测。 支原体是一种很小的微生物，可通过孔径22m的滤膜。支原体、病毒污染在光学显微镜下难于察觉，细胞也能生长繁殖，但会影响实验结果。 检测支原体的方法很多，如培养法、PCR法、荧光染色法、电镜观察法等。,血清的质量标准,促生长效果 是血清重要的特性之一，应以培养的细胞来检测 克隆形成率：悬浮生长的细胞，有限稀释法，统计克隆生长百
7、分比。 贴瓶率测定：贴壁细胞，集落数占接种细胞数的百分比。 续传代培养：细胞培养七天收集细胞，计数，取平均值。连续测试三个周期以上，观察细胞生长状况。,血清的外观,好的血清应该是透明清亮，土黄色或棕黄色，无沉淀或极少沉淀，比较粘稠。 如血清浑浊、不透明、含许多沉淀物，说明血清污染或血清中的蛋白质变性。 若血清呈棕红色，说明血清中的血红蛋白含量太高，取材时有溶血现象。 摇晃时感觉液体稀薄，说明血清中掺入的生理盐水太多。,血清的使用与储存,使用前处理：灭活处理，即5630分钟。灭活的目的使去除血清中的补体成分。 储存条件：血清一般储存在-20 ，同时应避免反复冻融。使用前融化，融化时最好先置于4
8、，融化后的血清在4 不宜长时间存放，应尽快使用。 使用浓度：自从有了合成培养基，血清就是作为一种添加成分与合成培养基混合使用，使用浓度一般为5-20%，最常用是10%。,使用血清的优缺点,牛血清的优点 来源充足 制备技术成熟 经过长时间的应用有比较深入的理解 细胞培养中使用血清的缺点 改变某种细胞在体内的正常状态 含有一些对细胞会产生毒素的物质 每批血清都有差别，其成分不能保持一致 取材过程有可能带入支原体、病毒,三、合成培养基,如何选择培养基 培养基的配制 无血清培养基 无蛋白培养基 限定化学成分培养基,三、合成培养基,基本培养基种类,如何选择培养基,培养基的配制,无血清培养基,即不需要添加
9、血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。 如观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时需要排除其他生长因子的干扰作用，而血清中可能含有各种生长因子； 又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质（抗体、生长因子）的能力；或者要大规模的培养某种细胞，以获得他们的分泌产物。,无血清培养基的基本配方,基础培养液以HamF12和DMEM最为常用，一般两者以1：1混合。 添加组分包括以下几大类物质： 促贴壁物质：贴壁细胞，无血清培养基中一定要添加促贴壁和扩展因子。 促生长因子及激素：针对不同细胞添加不同的生长因子。激素也是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质，有些激素是许多细胞必不可少的，如胰
10、岛素。,酶抑制剂：培养贴壁生长的细胞，需要用胰酶消化传代，在无血清培养基中必不可少须含酶抑制剂，以终止酶的消化作用，达到保护细胞的目的，最常用的是大豆胰酶抑制剂。 结合蛋白和转运蛋白：转铁蛋白和牛血清蛋白。牛血清蛋白的添加比较大，可增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤。许多旋转式培养的无血清培养基都含有牛血清白蛋白。 微量元素：硒是最常见的。,无蛋白培养,即不含有动物蛋白的培养基。 无血清培养基仍含有较多的动物蛋白，如胰岛素，转铁蛋白、牛血清蛋白等。许多利用基因工程技术重组的蛋白质最终要应用于人体，如果生长过程中使用了含有动物蛋白质的培养基，纯化过程就比较复杂。 许多无蛋白培养基添加了植物水
11、解物以替代动物激素、生长因子的作用。目前已经有适合于CHO细胞生长的PFM，PFM只适合于悬浮生长的细胞。,限定化学成分培养基（CDM）,培养基中的所有成分都是明确的。 它不含有动物蛋白，也不添加植物水解物，而是使用了一些已知结构与功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。 有利于分析细胞的分泌产物，目前已经有适合于293细胞、CHO细胞、杂交瘤细胞生长的CDM，CDM只适合于悬浮生长的细胞。,四、其他培养用液,平衡盐溶液 消化液 pH调整液,平衡盐溶液（BSS）,组成：主要由无机盐、葡萄糖组成 作用：维持细胞渗透压平衡，保持pH稳定及提供简单的营养 用途：用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配
12、制其他试剂。 配制溶液应使用双蒸水或去离子水。如果配方中含有钙离子、镁离子，应当先溶解这些成分，配好的平衡盐溶液可以过滤除菌或高温灭菌。,消化液,用途：取材进行原代培养时需要将组织块消化解离形成细胞悬液；传代培养时也需要将贴壁细胞从瓶壁上消化下来。 胰酶溶液 胰酶的活性可以用消化酪蛋白的能力表示，常见1:125和1:250 组织培养用的胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%的浓度，配制时要用不含钙离子和镁离子及血清的平衡盐溶液。 胰酶作用及溶解的最佳pH8-9，配制胰酶溶液应将液体调整pH8.过滤除菌。,消化液,EDTA溶液：用了解离细胞，主要是破坏细胞间的连接。对于一些贴壁特别牢固的细胞，还可
13、以用EDTA和胰酶的混合液进行消化。 EDTA使用浓度为0.02%，配制时应加碱助溶，配制后可过滤除菌，也可高温消毒灭菌。,胶原酶溶液 胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用，胶原酶作用的对象是胶原组织，因此不容易对细胞产生损伤。 胶原酶的使用浓度为0.1-0.3mg/L或200000U/L，作用的最佳pH6.5胶原酶不受钙离子、镁离子及血清的抑制，配制时可以PBS。,pH调整液,抗生素,五、培养物的污染及防止,细菌污染对培养细胞的影响及污染物的检测 常见的污染细菌有大肠杆菌、假单胞菌、葡萄球菌等。 细菌污染初期由于双抗作用，污染情况用倒置显微镜观察不易判断。 被污染液大多可改变pH,使培养液变
14、浑浊、变色。 用青霉素、链霉素可以预防细菌污染有效。,真菌污染对细胞的影响及污染物的检测,被污染后易于发现，大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面，肉眼可见；有的散在生长，镜下可见呈丝状、管状、树枝状，纵横交错穿行于细胞间。念珠菌和酵母菌卵圆形，散在细胞周边和细胞之间生长。 真菌生长迅速，能在短时间内抑制细胞生长、产生有毒物质杀死细胞。 抗真菌制剂对预防和排除真菌污染有效。,支原体污染对细胞影响及污染物的检测,支原体是介于细菌和病毒之间、能独立生活的最小微生物，无细胞壁，形态呈多形，最小0.2um可以通过过滤器。常在购买各种血清中含有支原体。 被他污染后，他们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存，细胞无明显变化，实则细胞受到多方面潜在影响，如引起细胞变形，影响DNA合成，抑制细胞生长。 用卡拉霉素预防支原体污染有效。,污染的排除,抗生素排除法 加温除菌 动物体内接种 与巨噬细胞共同培养,维生素功能,