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1、酶工程第五章 酶分子修饰第节 金属离子置换修饰 通过改变酶分于中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法称为金属离子置换修饰。简称为离子置换法。有些酶含有金属离子。而且金属离子往往是酶活性中心的组成部分，对酶的催化功能起重要作用。例如：-淀粉酶的 ，谷氨酸脱氢酶的 ，过氧化氢酶中的 等等。若从酶分子结构中除去其所含的金属离子，酶往往会失活，若重新加入原有的金属离子，酶可以恢复原有活性，若加进不同的金属离子，则可使酶呈现不同的特性。有的可使酶活性降低，甚至失活；有的却可使酶的活力提高并增加酶的稳定性。2Ca2Zn2Fe第节 金属离子置换修饰 用于酶分子修饰的金属离子，往往是二价金属离子。例
2、如 等等。金属离子置换修饰法只适用于本来在结构中含有金属离子的酶。在离子置换修饰的过程中，首先要加入一定量的乙二胺四乙酸(EDTA)等金属螯合物到酶液中，使酶分子中的金属离子与EDTA形成螯合物，此时酶成为无活性状态。通过透析或超滤、分于筛层析等方法，可将EDTA-金属螯合物从酶液中分离除去。然后用不同的金属离子加到酶液中，酶蛋白与金属离子结合。根据离子种类的不同，经离子置换后的酶将会出现不同的特性。有些修饰酶活性比原来酶的活性降低，甚至完全无活性；有些修饰酶的活性比原酶活性提高；有些修饰酶的稳定性比原酶增加等。所以只要选择到适宜的金属离子作修饰剂，去置换原来的金属离子，就有可能提高酶活力，增
3、加酶稳定性。2222222,FeCuCoZnMnMgCa第二节 大分子结合修饰 利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法称为大分子结合修饰法。简称为大分子结合法。通常使用的水溶性大分子修饰剂有：有旋糖酐、聚乙二醇、肝素、蔗糖聚合物(Ficoll)、聚氨基酸等。这些大分子在使用前一般需经过活化，然后在一定条件下与酶分子以共价键结合。对酶分子进行修饰。例如：右旋糖酐先经高碘酸(HIO4)活化，然后与酶分于的氨基共价结合。第二节第二节 大分子结合修饰大分子结合修饰 第二节第二节 大分子结合修饰大分子结合修饰 由于酶的结构各不相同，所以不同的酶所结合的修
4、饰剂的种类和数量也有所差别，修饰后酶的特性和功能的改变情况也不一样。必须通过试验确定最佳的修饰剂的种类和浓度。操作时需根据所要求的分子比例控制好酶和修饰剂的浓度，并控制好温度、pH值和反应时间等修饰条件，以便获得理想的修饰效果。大分子结合修饰品是目前应用最广的酶分子修饰方法。经过此法修饰的酶可显著提高酶活力，增加稳定性或降低抗原性。第二节第二节 大分子结合修饰大分子结合修饰 一、通过修饰提高酶活力 酶的催化能力受诸多因素的影响。本质上是由其特定的空间结构，特别是由其活性中心的特定构象所决定的。水溶性大分子通过共价键与酶分子结合后，可使酶的空间结构发生某些改变，使酶的活性中心更有利于和底物结合，
5、并形成准确的催化部位，从而使酶活力得以提高。例如：每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可使该酶的活力提高到原有的活力的2.25倍；用右旋糖酐修饰胰凝乳蛋白酶，当每分子酶与11分子右旋糖酐结合时，修饰酶的活力达到原有的活力的5.1倍；每分子胰蛋白酶用11分子的右旋糖肝修饰后，酶活力可提高30等。第二节第二节 大分子结合修饰大分子结合修饰 二、通过修饰增加酶的稳定性 各种酶在保存或使用一段时间以后，由于受到各种因素的影响，原来完整的空间结构将会逐渐受到破坏，致使酶活力逐步降低，最后完全丧失其催化功能。可见酶的稳定性较低是普遍存在、有待提高的问题。酶的稳定性可用其半衰期来表示。酶的半衰期是指
6、酶的活力降低到原来活力一半时所经过的时间。不同的酶有不同的半衰期。有的酶半衰期长，说明其稳定性好，而稳定性差的酶其半衰期则短。有些作为药物使用的酶，进入体内后由于受机体各种因素的影响，往往稳定性差，半衰期短。例如，对治疗血栓有显著疗效的尿激酶，在人体内半衰期只有220min；有多种疗效的超氧物歧化酶，在人体内半衰期仅为6min左右等等。为此，如何增加酶的稳定性，延长酶的有效作用时间，是酶工程的一大重要课题。第二节第二节 大分子结合修饰大分子结合修饰 为了使酶的稳定性增加，必须设法使酶的空间结构稳定，特别要使酶活性中心的构象得到保护。采用其他大分子与酶合，形成复合物，就可起到保护酶的天然构象的作
7、用，从而增加酶的稳定性。可以与酶结合的大分子很多。归纳起来，可分为不溶于水和溶于水两大类。用不溶于水的大分子与酶结合制成固定化酶后，酶的稳定性可显著增加。而用可溶于水的大分子与酶结合进行酶分子修饰，可在酶的外围形成保护层，使酶的空间构象免受其他因素的影响，从而增加酶的稳定性，延长其半衷期。现以超氧物歧化酶(SOD)为例说明如下：第二节 大分子结合修饰 超氧物歧化酶SOD，属氧化还原酶类。SOD广泛存在于生物体内。它可以催化超氧负离子(O2-)进行氧化还原反应。反应时，一个超氧负离子被还原为双氧水，同时另一个超氧负离子氧化为氧气。其反应方程式如下：第二节 大分子结合修饰 由于SOD能消除体内的超
8、重负离子，所以受到医药界的极大关注。实验证明，外源SOD具有保护DNA、蛋白质和细胞膜的作用，使它们免遭超氧负离子的破坏。对治疗类风湿性关节炎、白内障、膀胱炎、皮肤炎、红斑狼疮等疾病疗效较好，对辐射有防护作用。同时，不管用何种给药方式，均没有发现任何副作用。由此可见，SOD是一种很有前途的药用酶。然而，超氧物歧化酶在体内稳定性差，当采用静脉注射方式给药时，SOD在体内的半衰期只有630min，这大大影响其使用效果。用水溶性大分子结合法修饰超氧物歧化酶，可使其在体内的稳定性显著提高，半衰期可延长70300多倍。并可明显抑制注射时出现的局部刺激反应。第二节 大分子结合修饰 此外，修饰酶的热稳定性可
9、显著提高，并具有较强的抗蛋白酶水解、抗酸碱以及抗氧化的能力。例如：L-天门冬酰胺酶用聚丙氨酸结合修饰后，其对热的稳定性大大提高；木瓜蛋白酶与右旋糖酐结合，显著增强其抗酸碱和抗氧化能力。三、通过修饰降低或消除抗原性 当外源蛋白非经口进入人或动物体内后，体内血清中就可能出现与此外源蛋白特异结合的物质。这些物质称为抗体。能引起体内产生抗体的物质称为抗原。第二节 大分子结合修饰 酶大多数是从动物、植物或微生物中获得的蛋白质。对于人体来说是一种外源蛋白。当酶非经口(如注射)进入人体后，往往会成为一种抗原，刺激体内产生抗体。当这种酶再次注射进体内时，抗体就会与作为抗原的酶特异地结合，而使酶失去其催化功能。
10、所以药用酶的抗原性问题是影响酶在体内发挥其功能的重要问题之一。抗体与抗原之间的特异结合是由于它们之间特定的分子结构所引起的。若抗体或抗原的特定结构改变，它们之间就不再特异地结合。故此采用酶分子修饰方法使酶的结构产生某些改变，就有可能降低甚至消除其抗原性。利用水溶性大分子对酶进行修饰，是降低甚至消除酶的抗原性的有效方法之一。例如，精氨酸酶经聚乙二醇(PEG)结合修饰后，其抗原性显著降低；用聚乙二醇对色氨酸酶进行修饰，可完全消除该酶的抗原性；聚乙二醇结合修饰后的L-天门冬酰胺酶，其抗原性可完全消除。第三节 肽链有限水解修饰 酶的催化功能主要决定于酶的活性中心的构象，活性中心部位的肽段对酶的催化作用
11、是必不可少的，而活性中心以外的肽段起到维持酶的空间构象的作用。酶蛋白的肽链被水解以后，将可能出现以下3种情况中的一种。若肽链水解后引起酶活性中心的破坏，则酶将失去其催化功能；若将肽链的一部分水解后，仍可维持其活性中心的完整构象，则酶的活力仍可保持或损失不多；若肽链的一部分水解除去以后，有利于活性中心与底物的结合并且形成准确的催化部位的话，则酶可显示出其催化功能或使酶活力提高。在后两种情况下，肽链的水解在限定的肽键上进行，称为肽链有限水解。利用肽链的有限水解，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性和功能的方法，称为肽链有限水解修饰。第三节 肽链有限水解修饰 有些酶蛋白原来不显示酶活性
12、或酶活力不高，利用某些具有高度专一性的蛋白酶对它进行肽链有限水解修饰，除去一部分肽段或若干个氨基酸残基，就可使其空间构象发生某些精细的改变有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，从而显示出酶的催化活性或提高酶活力。例如：胰蛋白酶原不显示酶活性，用蛋白酶进行修饰，使该酶原水解除去一个六肽，即可显示出胰蛋白酶的催化活性；天门冬氨酸酶通过胰蛋白酶进行修饰，从其羧基末端水解切除10多个氨基酸残基的肽段，可使天门冬氨酸酶的活力提高45倍以上。第三节 肽链有限水解修饰 有些酶原来具有抗原性，这除了酶的结构特点以外，还由于酶是大分子。蛋白质的抗原性与其分子大小有关，大分子的外源蛋白往往出现较强的抗原性
13、；而小分子的蛋白质或肽段，其抗原住较低或者无抗原性。所以，若将酶分子经肽链有限水解，其分子量减小，就会在保持其酶活力的前提下，使酶的抗原性显著降低，甚至消失。例如：将木瓜蛋白酶用亮氨酸氨肽酶进行有限水解，使其全部肽链的三分之二被水解除去，该酶的酶活力保持不变，而其抗原性大大降低。又如：酵母的烯醇化酶经有限水解除去由150个氨基酸组成的肽段后，酶活力仍可保持，抗原性却显著降低。对酶进行肽链有限水解，通常使用专一性较强的蛋白酶或肽酶为修饰剂。此外也可采用其他方法使肽链部分水解，达到修饰目的。例如，枯草杆菌中性蛋白酶，先用EDTA处理，再经纯水或稀盐缓冲液透析，可使该酶部分水解，得到仍有蛋白酶活性的
14、小分子肽段，用作消炎剂使用时，不产生抗原性，表现出良好的治疗效果。第四节 酶蛋白侧链基团修饰 酶蛋白侧链基团就是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。这些功能基团主要有氨基、羧基、巯基、咪唑基、吲哚基、酚羟基、羟基、胍基、甲硫基等。这些基团可组成各种副键，对于蛋白质空间结构的形成和稳定起着重要作用。如果这些功能基团发生改变，就会引起副键的改变，使空间结构发生某些改变，从而引起酶的特性和功能的改变。酶蛋白侧链基团的修饰可以使用各种小分子物质，也可使用各种大分子物质。其中使用水溶性大分子与侧链基团结合的属大分子结合修饰，已在本章第二节阐述。使用不溶性大分子与酶侧链基团结合的属于结合固定化方法，将在下
15、一章介绍。本节主要介绍各种小分子化合物与酶蛋白侧极基团相互作用的修饰方法。第四节 酶蛋白侧链基团修饰 酶蛋白侧链基团修饰一般采用化学手段，故属于化学修饰法。所采用的各种小分子化合物称为侧链基团修饰剂。不同的侧链基团所使用的修饰剂各不相同，可根据需要加以选择。现将几种常用的小分子侧链基因修饰剂介绍如下：一、氨基修饰剂 凡能使酶蛋白侧链上的氨基发生改变的化台物，称为氨基修饰剂。主要的有：二硝基氟苯、醋酸酐、琥珀酸酐、二硫化碳、亚硝酸、乙亚腔甲酯、O-甲基异脲、顺丁烯二酸酐等。这些修饰剂作用于酶蛋白侧键上的氨基或产生脱氨基作用，或与氨是共价结合将氨基屏蔽起来，使氨基原有的副链改变，从而改变酶蛋白的构
16、象。第四节 酶蛋白侧链基团修饰 二、羧基修饰剂 可与酶蛋白侧链上的羧基反应的小分子化合物称为羧基修饰剂。羧基修饰剂可使羧基酯化、酰基化或结合生成其他物质，改变酶蛋白的空间构象，从而改变酶的某些特性与功能。最早用来修饰蛋白质侧链羧基的修饰剂是乙醇-盐酸试剂，它可使羧基产生酯化作用。此外，水溶性的碳化二亚胺、异恶唑盐等也可选择性地对羧基进行修饰。三、胍基修饰剂 精氨酸含有胍基。胍基可与二羰基化合物缩合生成稳定的杂环。所以二羰基化合物，如环已二酮、乙二醛、苯乙二醛等，都可以用作胍基修饰剂。经过胍基修饰后的酶蛋白，其空间构象将有所改变 第四节 酶蛋白侧链基团修饰 四、巯基修饰剂 蛋白质的半胱氨酸残基侧
17、锭中含有巯基。巯基在许多酶中充当活性中心的催化基团，巯基可与另一巯基形成二硫键，对维持酶的结构稳定性起重要作用。若经修饰，使酶蛋白侧链的巯基发生改变，将对酶的特性或功能起显著影响。常用的巯基修饰剂有：二硫苏糖醇、巯基乙醇、硫代硫酸盐、硼氢化钠等还原剂以及各种酰化剂、烷基化剂等。五、酚基修饰剂 蛋白质的酪氨酸残基上含有酚基。修饰酚基的主要方法有碘化法、硝化法和琥珀酰化法等。经酚基修饰剂修饰后，酶分子由于引入负电荷，因而增加了对带正电荷的底物的结合力，有利于酶催化功能的发挥。例如：四硝基甲烷(TNM)可使酚基硝化生成硝基酚残基等。第四节 酶蛋白侧链基团修饰 六、分子内交联剂 用含有双功能团的化合物
18、，如二氨基丁烷、戊二醛、己二胺等，与酶分子内两个侧链基团反应，在分子内共价交联，可使酶分子空间构象更加稳定，从而也使酶的催化稳定性增加。酶蛋白侧链基团修饰在蛋白质和酶的结构与功能的基础研究、酶的催化机制等酶学研究方面有重要作用。而在酶工程中运用此修饰方法与上述基础研究的要求有所不同。基础研究只要求阐明其结构、功能、机制等理论问题，研究后的蛋白质或酶特性和功能有否改变是不必过问的，更不必关心其能否在实际中应用这些经修饰后的蛋白质或酶。然而在酶工程中，经过修饰的酶，其酶活力应保持或损失不多，同时应具有新的特性和功能，以便更好地在实际中应用。故此，在酶工程方面使用的化学修饰剂应是无毒并廉价易得的。必
19、须根据需要加以选择。第四节 酶蛋白侧链基团修饰 酶经侧链基团修饰后，对于酶的活性、稳定性或抗原性都有显著影响，往往可提高其使用价值。例如：用O-甲基异脲修饰溶菌酶，使赖氨酸残基的-氨基与之结合，修饰后酶活力保持不变，但稳定性提高，且很容易结晶析出；用亚硝酸修饰天门冬酰胺酶，使其氨基末端的亮氨酸和肽链中的赖氨酸的氨基脱去变成羟基，经修饰后，该酶的稳定性大大提高，在体内的半衰期可延长2倍，显著提高治疗效果；枯草杆菌蛋白酶的第l 04位酪氨酸可特异地被碘化、硝化和琥珀酰化，经修饰后的酶，由于负电荷能引入，而增加了对带正电荷底物的结合力；葡萄糖异构酶经琥珀酰化修饰后，其最适pH值下降0.5单位，并增加
20、酶的稳定性，这对果葡糖的生产有利。第四节 酶蛋白侧链基团修饰 已知大肠杆菌的苹果酸酶可催化下列4种生化反应：该酶的巯基用乙基马来酰亚胺修饰后，其催化 主反应A的功能消失，同时也失去催化反应B的能力，然而催化反应C和D的酶活性却提高10倍以上。第五节 氨基酸置换修饰 酶蛋白是由各种氨基酸通过肽键联结而成的。在特定位置上的各种氨基酸是酶的化学结构和空间结构的基础。若将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，则会引起酶蛋白空间构象的某些改变，从而改变酶的某些特性和功能，这种修饰方法，称为氨基酸置换修饰。通过氨基酸置换修饰，可以提高酶活力或增加酶的稳定性，更有利于酶的应用。例如：酪氨酰-tRNA合成酶可
21、催化酪氨酸和其所对应tRNA合成酪胺酰tRNA，若将该酶第51位的苏氨酸(Thr51)由脯氨酸置换，经修饰后的酶对ATP的亲和性提高近l00倍，酶活力提高25倍；T4-溶菌酶分子中第3位的异亮氨酸(ILu3)换成半胱氨酸后，该半肮氨酸(Cys-3)可与第97位的半胱氨酸(Cys-97)形成二硫键，氨基酸置换修饰后的T4-溶菌酶，其活力保持不变，但该酶对热的稳定性却大大提高。第五节 氨基酸置换修饰 氨基酸置换修饰除了在酶工程方面应用之外，还可用来修饰其他功能蛋白质或多肽分子。例如：-干扰素原来稳定性差。这是由于其分子中含有3个半胱氨酸，其中2个半胱氨酸的巯基连结形成二硫键，而另一个在第17位的半
22、肮氨酸(Cys-17)的巯基是游离的。当-干扰素分子的游离巯基与另个-干扰素的游离巯基相结合形成二硫键时，-干扰素就失去其活性。若将这个半胱氨酸(Cys-17)用丝氨酸置换，就使-干扰素不会生成二聚干扰素，从而大大提高其稳定性。经修饰后的-干扰素在低温条件下保存半年，仍可保持其活性不变，这就为-干扰素的临床使用创造了条件。第五节 氨基酸置换修饰 氨基酸置换修饰可以用化学方法进行。例如：Bender和Koshland成功地用化学方法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，经修饰后，该酶对蛋白质和肽的水解能力消失，但却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化学方法进行氨基酸置换，难度较大
23、，受到诸多限制。80年代兴起和发展起来的蛋白质工程，为氨基酸置换修饰提供了行之有效的可靠手段。蛋白质工程又被称为第二代遗传工程。是指通过改造与蛋白质相对应的基因中的碱基排列次序，或设计合成新的基因，将它克隆到寄主细胞中，通过基因表达而获得具有新的特性的蛋白质的技术过程。第五节 氨基酸置换修饰 蛋白质工程主要步骤如下：1.新蛋白质结构的设计 根据已知的蛋白质或酶的化学结构、空间结构及其特性，确定欲得到的新蛋白质或酶的氨基酸排列次序。确定欲置换的氨基酸及位置。2.突变基因的核苷酸序列的确定 根据欲得到蛋白质的氨基酸序列，确定其对应的m RNA上的核苷酸序列，再根据互补原则，从mRNA核苷酸序列确定
24、其所对应的突变基因上的核苷酸序列。依据欲置换的氨基酸确定需要置换的核苷酸及其位置。第五节 氨基酸置换修饰 3.突变基因的获得 根据欲得到的突变基因的核苷酸序列以及需要置换的核苷酸位置，首先用DN A合成仪合成有一个或几个核苷酸被置换了的寡核苷酸，再用此寡核苷酸为引物，通过定点突变(site directed mutagenesis)技术，而获得所需的突变基因。这称之为寡核苷酸诱导的定位突变，是蛋白质工程中最常用的技术。第五节 氨基酸置换修饰 利用定位突变技木，突变基因中所需置换的核苷酸数目往往很少。若需在肽链中置换一个氨基酸，其所对应的基因上只需置换13个核苷酸。例如，上述-干扰素的修饰是将第
25、17位的半胱氨酸换成丝氨酸，故此只需在其对应基团的对应位点上将ACA或ACG(转录后mRNA上遗传密码为UGU或UGC)换成TCA或TCG(转最后为AGU或AGC)，实际上突变基因是在某特定位点上将A换成T即可；酪氨酰-tRNA合成酶的修饰是将第51位的苏氨酸由脯氨酸置换，苏氨酸的密码子是ACU，ACC，ACA，ACG，而脯氨酸的密码于为CCU，CCC，CCA，CCG，虽然苏氨酸和脯氨酸各有4种密码子，但在mRNA上只需将A换成C，在对应基因的位点上将T换成G即可；T4-溶菌酶的修饰是将第3位的异亮氨酸(对应基因位点上的碱基顺序为TAA或TAG)置换成半胱氨酸(对应基因位点的碱基顺序为ACA或
26、ACG)，只需在相应基因的位点上置换2个核苷酸，即由AC置换TA即可。第五节 氨基酸置换修饰 4新蛋白质的产生 将上述获得的突变基因插入到合适的基因载体中，转化或转导到宿主细胞之中，在适宜的条件下进行表达，就可以产生出经过氨基酸置换的新的蛋白质或酶。第六节 物理修饰 通过各种物理方法，使酶分子的空间构象发生某些改变，而改变酶的某些特性和功能的方法称为物理修饰。物理修饰的特点在于不改变酶的组分和基因，酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理方法的作用下，副键发生某些变化和重排。例如：羧肽酶经高压处理后，底物特异性发生改变，有利于催化肽的合成反应，而水解反应的能力降低；用高压方法处理纤维素酶以后，该酶的最适温度有所降低，在3040的条件下，高压修饰酶比天然酶的活力提高10。第六节 物理修饰 酶分子空间构象的改变还可在某些变性剂的作用下，先使酶原有空间构象破坏，然后在不同的条件下，使酶分子重新构建新的构象。例如：先用盐酸胍等变性剂使胰蛋白酶的原有构象破坏，通过透析除去变性剂后，在不同温度下，使酶重新折叠形成新的构象。结果表明，50条件下重新构建构象的胰蛋白酶的稳定性比在20下重建构象的酶提高5倍。天然胰蛋白酶的稳定性与20条件下重建构象的酶的稳定性基本相同。