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1、实验四、五：目的基因的PCR扩增、 PCR产物的琼脂糖凝胶检测与 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,一、实验目的,1. 教学目的：PCR反应、产物检测的基本原理与实验技术 2.能力目标：具有PCR扩增体系设计、参数设置基本能力，掌握扩增产物检测方法,二、实验原理,1.PCR(聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)原理:体外快速扩增特定基因或DNA序列,PCR动画,2.聚丙烯酰胺凝胶检测原理,聚丙烯酰胺凝胶有效分离笵围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰胺交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，并形成D
2、NA分子通过的小孔。这些小孔的孔径随 “双丙烯酰胺丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有1-2bp 的DNA,三、仪器、材料和试剂,(一)仪器 PCR扩增仪、 琼脂糖凝胶电泳系统（琼脂糖水平电泳槽和电泳仪）、紫外透射仪或凝胶成像分析系统、移液器（2,10,20,200,1000l）、磁力搅拌器、垂直板电泳槽、水平摇床、枪头等耗材。,（二）试剂、材料 1.试剂：10PCR缓冲液(含Mg2) 、 dNTP混合物、 Taq酶、质粒DNA模板、引物对（正向引物和反向引物） 、PCR 管
3、、丙烯酰胺、过硫酸胺、N,N,N,N-四甲基二乙胺（TEMED）、Tris碱、硼酸、Na2EDTA2H2O、冰醋酸、无水乙醇、Na2OH、AgNO3、甲醛、10 m mol/L dNTP混合物、 5U/uL Taq DNA聚合酶、10 PCR Buffer、50xTAE、引物对（鲤微卫星引物对）、过硫酸铵。 2.材料：1ng/ uL DNA模板,3.教师预备实验：引物对筛选。（说明，该引物对为教师科研过程中筛选引物对，参考文献：岳兴建, 邹远超，王永明等.元江鲤种群遗传多样性. 生态学报. 2013, 33(13).）,4.储存液,5TBE 、10%过硫酸铵(AP) 、30%丙烯酰胺母液,四、
4、实验步骤 (一)PCR,1.PCR方案编制,6个样本/同学，建议编制8个样本量以便分样,取样后要标记,2.在1.5mL离心管中混合反应液，振荡混合,3.0.2mLPCR管加模板,4.分液,5.振荡混合，置于PCR仪内 6.PCR仪上参数设定， Run。,（二）琼脂糖凝胶电泳检测PCR的结果 （三）PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测,1.聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染过程中所用的溶液配制 10%过硫酸铵(AP) 8-12%聚丙烯酰胺凝胶的配制（自行选择，建议6%-10%） 染色液、显影液,2.聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳,(1)清洗制胶玻璃板，烘干后，组装玻璃板，用1.0%的琼脂糖封底； (2)按
5、照配方表将各组分混匀，混匀后迅速灌胶；（注意防止气泡产生）,(3)当胶灌至离玻璃板上缘0.5 cm 时停止灌胶，插入梳子，注意梳齿下不能有气泡，室温下聚合13小时； (4)凝胶聚合完全后，轻轻拔出梳子； (5)在PCR产物中加入5 L左右上样缓冲液，用微量进样器取8L混合液，加到点样孔，同时留出1个点样孔加入分子量标记物Marker,3.聚丙烯酰胺凝胶电泳的银染检测（4步）,参考文献：梁宏伟，王长忠，李忠，等. 聚丙烯酰胺凝胶快速、高效银染方法的建立.遗传.2008,30（10）. 1)电泳结束后关闭电泳议，倒出电泳缓冲液1TBE，取出凝胶，剥到染色盒中，注意不要弄破胶，然后用双蒸水中漂洗1一
6、2次,1-2min/次； (2)固定：加入固定液，在摇床上轻摇固定30min，把固定液倒入到一个容器中，以便做终止使用；用双蒸水洗2次，每次漂洗时间不超过1min，洗的过程中缓慢摇动，倒去双蒸水；（通常有这步，我们省掉.Why?见通过染色液、固定液配方分析） (3)染色：加入染色液，在摇床上轻摇染色20min，然后双蒸水迅速漂洗2次，每次漂洗时间不超过20s，漂洗过程中缓慢摇动，倒去双蒸水； (4)显色：加入显色液，在摇床上轻摇显色，观察显色情况，出现比较清晰的条带时就停止显色，然后双蒸水迅速漂洗2次（通常是这样操作，我们使用自来水冲洗，便可省掉下一步。Why?），洗的过程中缓慢摇动，倒去双蒸
7、水； (5)终止显色：把最初使用的固定液加入染色盒中，缓慢摇动5min，倒掉终止液，然后用双蒸水洗胶三遍，洗的过程中缓慢摇动，每次1min； (6)拍照：将胶置于凝胶成相系统上，白光下用数码相机进行拍照，保存照片用于带型分析。,1）电泳结束后关闭电泳议，倒出电泳缓冲液1TBE，取出凝胶，剥到染色盒中，注意不要弄破胶，然后用双蒸水中漂洗1一2次,1-2min/次；,5)显色：加入显色液，在摇床上轻摇显色，观察显色情况，出现比较清晰的条带时就停止显色，然后双蒸水迅速漂洗2次（通常是这样操作。使用自来水冲洗，便可省掉下一步。Why?），洗的过程中缓慢摇动，倒去双蒸水,五、注意事项,（1）掌握好PCR
8、反应中的引物终浓度。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体, 过低则降低产量； （2）模板量过多则可能增加非特异性产物，DNA中的杂质也会影响PCR的效率。 （3）银染检测过程中，电泳完成、染色完成一定要用双蒸水清洗！,六、实验安排,本实验1.5天内可做完。上午做PCR反应，下午做电泳检测，晚上聚丙烯酰胺电泳，次日上午染色。,七、作业,1）设计一个50ul的PCR反应体系； 2）设计一个扩增48个个体，20uL反应体系，退火温度为56度的PCR反应方案； 3）名词解释：PCR，预变性、变性、退火、退火温度、（引物的）延伸、引物、模板DNA、凝胶电泳、Taq DNA聚合酶、dNTP 4）PCR各步骤的目的是什么？,