《遗传实验.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《遗传实验.doc（9页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、实验五 细菌质粒DNA的提取一 实验目的 掌握碱裂解法提取质粒的方法。二、实验内容 本实验涉及细菌内质粒的提取方法。三、实验要求 采用集中授课、学生自主训练并重的模式组织教学。四、实验准备 学生需要与质粒相关的知识。五、实验原理、方法和手段 质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb 不等，为双链、闭环的DNA 分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活。质粒通常含有编码某
2、些酶的基因，如抗生素抗性基因、大肠杆菌素基因、肠毒素基因某些限制性内切酶与修饰酶基因等，因而它的存在使宿主具有一些额外的特性。F 质粒（又称F 因子或性质粒）、R 质粒(抗药性因子)和Col 质粒（产大肠杆菌素因子）等都是常见的天然质粒。质粒在细胞内的复制一般有两种类型：紧密控制型（Stringent contro l）和松驰控制型（Relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能复制，通常每个细胞内只含有1 个或几个质粒分子，如F 因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，一般在20 个以上，如Col E1 质粒。在
3、使用蛋白质合成抑制剂氯霉素时，细胞内蛋白质合成、染色体DNA 复制和细胞分裂均受到抑制，紧密型质粒复制停止，而松驰型质粒继续复制质粒拷贝数可由原来的20 多个扩增至1000-3000个，此时质粒DNA 占总DNA 的含量可由原来的2%增加至40-50%。利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在，当两种质粒同时导入同一细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争，在一些细胞中，一种质粒占优势，而在另一些细胞中另一种质粒却占优势。当细胞生长几代后，占少数的质粒将会丢失，因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性（Incompatibility）。但利用不同复
4、制系统的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体（Vector）。细菌质粒是重组DNA 技术中常用的载体。质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DNA 片段；（4）具有容易操作的检测表型。常用的质粒载体大小一般在1kb 至10kb 之间，如PBR322、PUC 系列、PGEM 系列和pBS等。与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标
5、记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。大多数质粒载体带有一些多用途的辅助序列，这些序列可用于产生序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。从细菌中分离质粒DNA 的方法都包括3 个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）和Triton X-100 可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS 或Triton X-100 处理后，细菌染色体DNA 会缠绕附着在细胞碎片上，
6、同时由于细菌染色体DNA 比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA 变性，而共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA 片段难以复性,，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起。而质粒DNA 双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。在细菌细胞内，共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA 外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA 两条链中有一条链发
7、生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成松驰型的环状分子，称开环DNA（Open circular DNA, 简称ocDNA）；如果质粒DNA 的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA（Linear DNA）。当提取的质粒DNA 电泳时，同一质粒DNA 其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。六、实验条件（一）菌株含PUCm-T 质粒的大肠杆菌（E. coli）DH5菌株。（二）实验仪器及用具1.5 mL Eppendorf离心管，微量取液器，台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。（三）药品和试剂1L
8、B 液体培养基（Luria-Bertani）：称取蛋白胨（Tryptone）10 g，酵母提取物（Yeast extract） 5 g，NaCl 10 g，溶于800 mL去离子水中，用NaOH调pH至7.5, 加去离子水至总体积1 L，高压下蒸气灭菌20 分钟。2LB 固体培养基：液体培养基中每升加12 g琼脂粉，高压灭菌。3氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）)母液：配成5 mg/ml水溶液, -20保存备用。4溶菌酶溶液：用10 mmol/L TrisHCl（pH8.0）溶液配制成10 mg/mL，并分装成小份保存于-20，每一小份一经使用后便予丢弃。53 mol/L NaAc（p
9、H5.2）： 50 mL水中溶解40.81 g NaAc3H2O，用冰醋酸调pH至5.2, 加水定容至100 mL, 分装后高压灭菌，于4贮存备用。6溶液：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），10 mmol/L EDTA （pH8.0）。 溶液可成批配制，每瓶100 mL，压灭菌15 分钟，于4贮存备用。7溶液：0.2 mol/L NaOH（临用前用10 mol/L NaOH母液稀释），1 SDS。8溶液：5 mol/L KAc 60 mL，冰醋酸 11.5 mL，H2O 28.5 mL，定容至100 mL, 并高压灭菌。9RNA 酶A 母液：将RNA
10、 酶A 溶于10 mmol/L Tris-HCl（pH7.5），15 mmol/L NaCl 中,配成10 mg/mL的溶液，于100加热15 分钟，使混有的DNA 酶失活。冷却后用1.5 mL Eppendorf 管分装成小份保存于-20。10Tris饱和酚：市售酚中含有醌等氧化物，这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA 和DNA的交联，应在160用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1的8-羟基喹啉（作为抗氧化剂），并用等体积的0.5 mol/L Tris-HCl（pH8.0）和0.1 mol/L Tris-HCl l（pH8.0）缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH 值达到7.6以上，因为酸性
11、条件下DNA 会分配于有机相。11按氯仿异戊醇241体积比在氯仿中加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。 按体积/体积11 混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿（11）。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。12TE 缓冲液：10 mmo/L Tris-HCl（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0）。高压灭菌后储存于4。13STET：0.1 mol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），10 mmol/L EDTA（pH8.0），5% Triton X-100。14STE：0.1 mol/L N
12、aCl，10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0）。七、实验步骤（一）细菌的培养和收集期。将含有质粒pUCm-T 的DH5菌种接种在LB 固体培养基（含50 g/mL Amp）中，37培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5 mL LB液体培养基（含50 g/mL Amp）中，37振荡培养约12小时至对数生长后期。（二）质粒DNA 的提取质粒DNA 小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA 十分有用。这些方法共同特点是简便、快速，能同时处理大量样品，所得DNA 有一定纯度，可满足限制酶切割、电泳分析的需要。1煮沸法（1）
13、将1.5 mL 培养液倒入Eppendorf 管中，4下12000 rpm（revolutions per minute，转/分）离心30秒。（2）弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。（3）将菌体沉淀悬浮于120 L STET溶液中，涡旋混匀。（4）加入10 L新配制的溶菌酶溶液（10 mg/mL），涡旋振荡3秒钟。（5）将Eppendorf 管放入沸水浴中，50秒后立即取出。（6）用微量离心机4下12000 rpm 离心10分钟。（7）用无菌牙签从Eppendorf 管中去除细菌碎片。（8）取20L 进行电泳检查。 注意（1）对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取
14、质粒DNA。（2）提取的质粒DNA 中会含有RNA，但RNA 并不干扰进一步实验，如限制性内切酶消化,，亚克隆及连接反应等。2碱法（乙醇沉淀）（1）取1.5mL培养液倒入1.5mL Eeppendorf 管中，4下12000 rpm 离心30 秒。（2）弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽。（3）菌体沉淀重悬浮于100L 溶液中(需剧烈振荡)，室温下放置5-10分钟。（4）加入新配制的溶液200L, 盖紧管口，快速温和颠倒Eppendorf管数次，以混匀内容物，冰浴5 分钟。（5）加入150L 预冷的溶液，盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒，使沉淀混匀，冰浴中5-10分钟，4下12
15、000 rpm离心5-10 分钟。（6）上清液移入干净的Eppendorf管中，加入等体积的酚/氯仿，振荡混匀，4下12000 rpm离心5分钟。（7）将水相移入干净Eppendorf管中，加入2 倍体积的无水乙醇，振荡混匀后置于-20冰箱中20分钟，然后4下12000 rpm 离心10 分钟。（8）弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1 mL70乙醇洗沉淀一次，4下12000 rpm 离心5-10 分钟。（9）吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10 分钟或室温干燥。（10）将沉淀溶于20L TE 缓冲液（pH8.0，含20g/mL RNase A）中，储于-2
16、0冰箱中。注意 （1）提取过程应尽量保持低温。（2）提取质粒DNA 过程中除去蛋白很重要，采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好，要将蛋白尽量除干净需多次抽提。（3）沉淀DNA 通常使用冰乙醇,，在低温条件下放置时间稍长可使DNA 沉淀完全。沉淀DNA 也可用异丙醇（一般使用等体积），且沉淀完全，速度快，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。3碱法（离心柱型质粒提取试剂盒，TIANGEN）（1）柱平衡步骤：将吸附柱CP4放入收集管，加入500L的平衡液BL,12000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。（2）取4mL过夜培养的菌液，加入干净的离心管中，1200
17、0 rpm离心1分钟，尽量吸除上清。（3）向留有菌体沉淀的离心管中加入500l溶液P1（含RNaseA，同溶液I），使用移液器或涡旋震荡器彻底悬浮细菌沉淀。（4）向离心管中加入500L溶液P2（同溶液II），温和地上下翻转4-6次使细菌细胞膜充分裂解（剧烈震荡将打断细菌基因组，造成提取的质粒混有基因组），此时离心管中的菌液变得清亮粘稠。（5）加入700L溶液P3（同溶液III），将管温和颠倒6-8次混匀，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀，12000 rpm离心10分钟。（6）将上一步收集的上清液分次加入过滤柱CS（过滤柱放入收集管中），12000 rpm离心2分钟，小心将离心后收集到的溶液分次
18、加入吸附柱CP4中（吸附柱放入收集管中）。（7）12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4重新放入收集管中。（8）向吸附柱CP4中加入500L去蛋白液PD，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。（9）向吸附柱CP4中加入600L漂洗液PW（含乙醇），12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。（10）向吸附柱CP4中加入600L漂洗液PW，12000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。（11）将吸附柱CP4重新放入收集管中，12000 rpm离心2分钟以除去吸附柱残余的漂洗液；（
19、12）将吸附柱CP4放入干净的离心管中，向吸附柱的中间部位滴加100L洗脱缓冲液TB缓冲液，室温静置2分钟，12000 rpm离心1分钟，离心管中的溶液即为质粒溶液。 注意 （1）离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA。八、实验作业 1在碱法提取质粒DNA操作过程中应注意哪些问题？2染色体DNA与质粒DNA分离的主要依据是什么？九、实验报告 实验报告要求包括实验目的、实验原理、实验材料、实验步骤、实验结果、结果分析及思考题。实验六 DNA的琼脂糖凝胶电泳一 实验目的 掌握琼脂糖凝胶电泳的方法。二、实验内容 本实验涉及DNA的水平槽电泳检验方法。三、实验要求 采用集中授课、学生自主训练
20、并重的模式组织教学。四、实验准备 学生需要掌握DNA的相关知识概念。五、实验原理、方法和手段琼脂糖（agarose）是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，常作为电泳支持物。琼脂糖凝胶电泳是常用的核酸、蛋白质分离与鉴定方法，它具有操作方便，设备简单，需样品量少及电泳速度快等优点。琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量质量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有关系。在琼脂糖凝胶（碱性溶液）中，DNA带有负电荷，在电场作用下朝正极移动，其迁移距离（迁移率）与碱基对数的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。因此，不同大小的DNA需
21、要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离（表6-1）。但是当DNA分子大小超过20kb时，DNA的电泳迁移率不再依赖于分子大小，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。表6-1 DNA在琼脂糖凝胶中的有效分离范围琼脂糖浓度（%）0.30.60.70.91.21.52.0线状DNA相对分子质量（kb）60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1不同构型DNA的移动速度不同，其次序为：共价闭环DNA（covalently closed circular，cccDNA）直线DNA开环的双链环状DNA。当琼脂糖浓度太高时，环状DNA（一般为球形）不能进入胶中，相对迁移率为0，而同等大小的直
22、线双链DNA（刚性棒状）则可以长轴方向前进。溴化乙锭可插入到DNA分子的双链中。在紫外光的照射下，插入溴化乙锭的DNA呈橙红色荧光，所以溴化乙锭可以作荧光指示剂指示DNA含量（检测限约为10 ng）和位置。用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型。由于水平型凝胶具有制胶和加样方便的优点，因而使用更多。水平型电泳时，凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下1-2 mm，故又称为潜水式。六、实验条件（一）材料 质粒DNA或其它分子量不同的DNA片段。（二）实验仪器及用具电泳仪、电泳槽、胶带、微波炉、凝胶成像仪（或紫外灯）等。（三）药品和试剂1TBE 缓冲液 (5)：称取 Tris 54g，硼酸27.5
23、g，并加入 0.5M EDTA (pH8.0) 20mL，定溶至1000mL。注意：缓冲液中缺少离子时，电流太小，DNA迁移慢；相反，高离子强度的缓冲液由于电流太大会大量产热，严重时，会造成胶熔化和DNA的变性。2上样缓冲液 (6)：0.25% 溴酚蓝，40% (w/v) 蔗糖水溶液。310 gmL溴化乙锭（EB）或者GoldenView溶液。注意：溴化乙锭是一种强烈的诱变剂并有中度毒性。使用含有该染料的溶液时必须戴手套。使用完后应该进行净化处理。通常用水配制成 10 mgmL的贮存液在室温下避光储存，使用终浓度为。七、实验步骤（一）琼脂糖凝胶的制备1用胶带将洗净、干燥的玻璃板的边缘（或电泳装
24、置所配备的塑料盘的开口）封住，形成一个胶膜。将胶膜放在工作台的水平位置上。在距离底板0.5-1.0 mm的位置上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。如果梳子距离玻璃板太近，则拔出梳子时孔底有破裂的危险，最后导致样品渗漏。2配制一定浓度的凝胶。在电泳缓冲液中加入琼脂糖，在沸水浴或微波炉中将悬浮液加热至琼脂糖溶解。3使溶液冷却至60，加入溴化乙锭（终浓度0.5 gmL），迅速充分混匀后倒入胶膜中。检查一下梳子的齿下或齿间是否有气泡。4在凝胶完全凝固后，小心移去梳子和胶带，将凝胶放入电泳槽中。5在电泳槽中加入没过胶面1 mm以上的足够的电泳缓冲液(0.5TBE)。（二）点样与电泳1DNA
25、样品与加样缓冲液混合后，用微量取液器一次加入样品槽中。一般DNA样品最好控制在0.51.0 g之间。2加完所有样品后，盖上电泳槽盖并通电，使DNA向阳极移动。采用一定电压（按照两极间距离计算，2-4 V/cm），几分钟后，溴酚蓝从加样孔中移出。继续电泳，直至溴酚蓝在凝胶中迁移出适当的距离。 3切断电流，打开槽盖，在紫外灯下检查凝胶。八、实验作业 1图示电泳检测结果并分析。九、实验报告 实验报告要求包括实验目的、实验原理、实验材料、实验步骤、实验结果、结果分析及思考题。实验七 同功酶遗传标记分析一 实验目的1掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳技术；2同工酶遗传标记的分析。二、实验内容 本实验涉及同工酶概念，
26、遗传标记知识，鲫鱼解剖及组织提取、和蛋白垂直电泳分离检验方法。三、实验要求 采用集中授课、学生自主训练并重的模式组织教学。四、实验准备 学生需要蛋白质结构知识以及酶反应相关知识。五、实验原理、方法和手段同工酶是一类由具有不同分子结构和大小但具有相同催化功能的酶。同工酶分子的多种形式是由基因决定的，也即同工酶是基因表达的直接产物。由同一基因座的不同等位基因编码的各种同工酶又称为等位酶，它们从分子水平上反映了等位基因的相对差异。因此，同工酶不仅是一种生理生化指标，而且也是一种可靠的遗传标记。在同工酶分析和鉴定中，电泳法是最为广泛应用，它能简便、快捷地分离某类酶的各同工酶组分，而不破坏酶的活力。电泳
27、的支持介质聚丙烯酰胺是目前最常用的。是由丙烯酰胺（acrylamide）单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺（bisacrylamide）在催化剂的作用下聚合成含酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻的两个链通过甲叉桥交链起来，链纵横交错，形成三维网状结构。丙烯酰胺的单体和双体的聚合有两种类型，一种是化学聚合，常采用过硫酸胺四甲基乙二胺（TEMED）催化系统。过硫酸胺是引发基团，供给游离氧基，TEMED是催化加速剂。另一种是光照聚合，常采用核黄素TEMED催化系统。核黄素在光下形成无色基，TEMED放氧再氧化，产生自由基，从而引发聚合作用。制备丙烯酰胺凝胶时其凝胶的孔径由凝胶浓度决定。当采用垂直平板不连续聚丙烯酰
28、胺凝胶电泳体系时，一般上层是大孔径的浓缩胶（pH 6.7），下层为小孔径的分离胶（pH 8.9），电泳缓冲液为Tris甘氨酸缓冲液（pH 8.3）。在这种不连续系统里，存在着电荷效应，分子筛效应和浓缩效应。蛋白质（酶）按其电荷效应和分子筛效应而被分离在凝胶的不同位置上。用此凝胶板与酶反应底物进行催化反应，再用生物染料染色便形成肉眼可见的各种酶带。图7-1乳酸脱氢酶催化的反应乳酸脱氢酸（lactate dehydrogenase，LDH）同工酶催化生物体内丙酮酸与乳酸之间的相互转化，是参与糖酵解途径的关键性酶，它在机体中的基本功能是调节NAD+（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，氧化型辅酶I）和NADH（烟
29、酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，还原型辅酶I）的比率（图7-1），从而对细胞的一系列复杂的生化反应起调控作用。不同样品间谱带的差异，反映了基因产物的差异。六、实验条件 （一）材料鲫鱼（市售）。（二）实验仪器及用具直流稳压电泳仪（VIW-型），垂直平板电泳槽及附件，磨口梨形真空抽气瓶，20 mL玻璃匀浆器，微量进样枪，离心机（3500 rpm），吸管，烧杯等。（三）药品和试剂A、凝胶组成液：130%凝胶贮液：取30g丙烯酰胺、0.8 g甲叉双丙烯酰胺，加水定容至100ml，过滤后至棕色瓶中，于4保存备用；2N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED），避光保存；310%过硫酸铵(APS)溶液：取1g过硫酸
30、铵溶解后，定容至10 mL (现配现用)；4分离胶缓冲液（1.5 mol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.8）：取18.15 g 三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶解后，加6 mol/L HCl溶液4 mL，调pH至8.8，定容至100 mL；5浓缩胶缓冲液（0.5 mol/L Tris-HCl缓冲液，pH6.8）：取6 g Tris溶解后，加6 mol/L HCl溶液8 mL，调pH至6.8，定容至100 mL；B、电极缓冲液（0.05 mol/L Tris，0.384 mol/L甘氨酸，pH=8.3）：取6 g Tris、28.8 g甘氨酸加水溶解后，调pH至8.3，定容至1000 mL；
31、C、样品匀浆液：100 mL 0.1 M磷酸缓冲液（pH7.2），加入20%的蔗糖，搅拌混匀后，加入1-2滴巯基乙醇，即为样品缓冲液。图7-2 乳酸脱氢酶显色反应D、染色液：1 M dl-乳酸钠溶液（pH=7.0）5 mL，pH8.0 Tris-HCl缓冲液10 mL，蒸馏水35 mL，NBT（氯化氮蓝四唑）15 mg，PMS（吩嗪硫酸甲酯）1 mg，NAD 25 mg，溶解后即为染液。显色原理及反应如图7-2。七、实验步骤（一）样品制备将鲫鱼解剖，取其肾、脑、心放于培养皿上称重，在低温下按16加入缓冲液样品进行组织匀浆，置于4冰箱中静置沉淀。4下10000 rpm离心20分钟，取上清液为样品
32、。（二）电泳1配胶根据所测定的蛋白质相对分子量的范围，选择适宜的分离胶。本实验分离胶浓度选用8%,浓缩胶浓度选用4%，按表7-1进行配制。2凝胶的灌制分离胶的配制：将已装好的垂直板制胶玻璃板模具（1 mm厚）倾斜45，小心倾入配制好的混匀的分离胶，至适当的高度后，用微量注射器沿玻璃板内壁缓慢注入1 cm左右的蒸馏水进行水封。水封的目的是隔绝空气中的氧，并消除凝胶表面的弯月面，使凝胶顶部的表面平坦。室温静置凝胶液进行聚合反应，凝胶与水的界面由清晰到逐渐消失，0.5-1h后聚合反应完成，水胶界面重新清晰出现，再静置30min使聚合完全，倾出凝胶层上方的水；浓缩胶的配制：分离胶聚合好后，除去水层，并
33、用滤纸吸干。然后用凝胶液漂洗一下分离胶顶部，去除漂洗胶液后，按同样的方法加入浓缩胶0.5-1.0 cm，排除气泡，快速插入样品槽模板梳子，静置聚合约60min，待凝胶聚合后取下样品刷，安装到电泳槽上；表7-1 聚丙烯酰胺凝胶电泳所需溶液及其配比试剂8%分离胶用量（20 mL）4%浓缩胶用量（10 mL）凝胶贮液（mL）5.31.3分离胶缓冲液（mL）14.5浓缩胶缓冲液（mL）1.3TEMED（L）2515水（mL）6.3410%AP溶液（L）75503加样排除加样孔内气泡，用微量加样器按编号向加样孔中加入酶液样品，加样体积为16 L，然后用注射器向加样孔加入电极缓冲液至满，以防止电泳时邻近孔
34、中酶液的扩散；4电泳将电泳槽一端稍倾斜（以排除电泳槽底部与电极缓冲液之间的气泡），轻轻放入盛有500 mL的电泳缓冲液的缓冲液槽中，电泳槽的底部要与电极液相连，且不留气泡。然后，在上部缓冲液槽中加入约500 mL电泳缓冲液。插入电源接头，正极在下，负极在上。恒压110 V电泳至样品进入分离胶后，再恒压200 V电泳大约3h后。5染色、脱色电泳结束后，移去玻璃板，取出凝胶平板，将凝胶浸没于染色液中，37保温染色约0.5h，然后取出用蒸馏水冲洗，条带清晰后照相，最后制版保存或放入固定液中保存。八、 实验作业 1绘出各种样品中同工酶谱，并说明酶谱差异。九、实验报告 实验报告要求包括实验目的、实验原理
35、、实验材料、实验步骤、实验结果、结果分析及思考题。实验八 人类ABO血型测定与群体分析一、实验目的1. 学习辨别血型的方法。2. 观察红细胞凝集现象，掌握ABO血型鉴定的原理。3. 推测个自的基因型，并能对群体是否符合HardyWeinberg遗传平衡定律进行检验。二、实验内容本实验涉及ABO血型，复等位基因间的互作，群体遗传，卡平方检验。三、实验要求采用集中授课、学生自主训练并重的模式组织教学。四、实验准备学生需要复习ABO血型系统，等位基因间的互作，卡平方检验，预习群体遗传学等方面的内容。五、实验原理、方法和手段血型是指红细胞的血型，是根据红细胞膜外表面存在的特异性抗原（镶嵌于红细胞膜上的
36、糖蛋白和糖脂）来确定的，这种抗原或凝集原是由遗传决定的。抗体或凝集素存在于血清中，它与红细胞的不同抗原起反应，产生凝集，最后溶解。人类ABO血型抗原就是是根据红细胞膜上有无特异性抗原（凝集原）A或B来划分的血液类型系统，将血型分为A型、B型、AB型、O型四种。ABO血型系统是1900年奥地利兰茨泰纳发现和确定的人类第一个血型系统。所谓A型指红细胞膜上存在A抗原，其血清中存在抗B抗体（凝集素），B型指红细胞膜上存在B抗原，其血清中存在抗A抗体, AB型指红细胞膜上存在A和B抗原，其血清中没有抗A或抗B抗体，O型则红细胞膜上没有A和B抗原，血清中同时存在抗A抗B抗体。具有A抗原的红细胞可被抗A抗体
37、凝集；抗B抗体可使含B抗原的红细胞发生凝集。输血时若血型不合会使红细胞发生凝集，引起血管阻塞和溶血反应，造成严重后果。所以在输血前必须做血型鉴定。血型鉴定可用红细胞凝集试验，通过正、反定型准确确定ABO血型。所谓正定型：即血清试验，用已知抗A、抗B分型血清来确定红细胞上有无相应的A抗原和B抗原；所谓反定型：即细胞试验，是用已知A细胞和B细胞来测定血清中有无相应的抗A或抗B。ABO血型鉴定诊断血清待测者红细胞受检者血型待检者血清诊断红细胞抗A血清抗B血清A红细胞B红细胞O红细胞-O+-+-A-+-+B+-+AB-哈迪-温伯格（Hardy-Weinberg）法则是群体遗传中最重要的原理，它解释了繁
38、殖如何影响群体的基因和基因型频率。这个法则是用Hardy,G.H (英国数学家) 和Weinberg，W.（德国医生）两位学者的姓来命名的，他们于同一年（1908年）各自发现了这一法则。他们提出在一个不发生突变、迁移和选择的无限大的相互交配的群体中，基因频率和基因型频率将逐代保持不变。哈迪-温伯格定律可分为3个部分：第一部分是假设：在一个无穷大的随机交配的群体中，没有进化的压力（突变、迁移和自然选择）；第二部分是基因频率逐代不变；第三部分：随机交配一代以后基因型频率将保持平衡：p2表示AA的基因型的频率，2pq表示Aa基因型的频率q2表示aa基因型的频率。其中p是A基因的频率；q是a基因的频率
39、。基因型频率之和应等于1，即p2 + 2pq + q2 = 1这个定律简而言之：在没有进化影响下当基因一代一代传递时，群体的基因频率和基因型频率将保持不变。当一位座位上有两个等位基因时，哈迪-温伯格定律告诉我们在平衡时基因型频率将是p2，2pq和q2,它等于等位基因的频率（p+q）2,假如存在3个等位基因A，B和C的话，它们的频率分别为p、q、r，在平衡时基因型的频率也等于等位基因频率的平方：（p+q+r）2 = p2+ q2+ r2 +2qp +2pr+2qr =p2(AA)+q2(BB)+ r2(CC)+2pq(AB)+2pr(AC)+2qr(BC)若等位基因是X-连锁的，雌性可以是纯合的
40、或杂合的，但雄性只带有一单个的X-连锁的等位基因。在雌性中X-连锁位基因其哈迪-温伯格频率是和常染色体座位是相同的：p2(xAxA) ,2pq (xAxB), 和q2(xBxB)。在雌性中基因型的频率将为p (xAy)和q(xBy)。和群体中等位基因的频相同。六、实验条件实验材料 实验者本人血液实验仪器及用具 显微镜、载玻片、盖玻片、刺血针、消毒牙签、酒精棉球。药品和试剂 A型和B型标准血清，消毒液（碘伏、碘丁、酒精）七、实验步骤1. 取一块清洁玻片，用记号笔划上记号，左上角写A字，右上角写B字。2. 用小滴管吸A型标准血清（抗B）一滴加入左侧，用另一小滴管吸B型标准血清（抗A）一滴加入右侧。
41、3. 用75酒精棉球消消毒无名指指端的皮肤或耳垂，待酒精干后，用无菌采血针刺破表皮，用毛细采血管取血一滴，玻片的每侧各放入一小滴血，用牙签搅拌，使每侧抗血清和血液混合。每边用一支牙签，切勿混用。4. 静置室温下1015分钟后，在白色背景下肉眼观察有无凝集现象，假如只是A侧发生凝集，则血型为B型；若只是B侧凝集，则为A型；若两边均凝集，则为AB型；若两边均未发生凝集，则为O型。这种反应的强度因人而异，所以必要时要借助显微镜才能确定是否出现凝集。5. 确定本人血型6. 统计本人，本班，本系血型，并对本系血型分布做Hardy-Weinberg平衡检验。八、思考题1写出血型测定的原理。2记住你自己的血型，通过你的血型推测一下父母可能的血型并说明原因。3调查本系各班同学的血型，计算基因频率，基因型，对本系同学这一群体是否符合HardyWeinberg遗传平衡定律给出你的结论，并分析其原因。九、实验报告实验报告要求包括实验目的、实验原理、实验材料、实验步骤、实验结果、结果分析及思考题。