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1、第一章 白血病治疗基础 第一节 造血和白血病干细胞生物学特性引言造血是产生数以亿计的白细胞、红细胞、血小板维持体内稳态的血细胞再生过程。造血干细胞是一小群永久生存、静止休眠、未分化的多能细胞，除了能增殖和向多个不同系别的造血祖细胞分化外，还可以自我复制。过去二十年清楚地认识到白血病干细胞在白血病发病过程中的核心作用。白血病干细胞具有和造血干细胞一样的基本特征，包括静止休眠、自我复制、极强的增殖能力和定向分化能力。一些科学甚至认为白血病是一种由正常造血干细胞经历突变后产生的少量白血病干细胞衍生的全新的异常造血组织。许多学者认为白血病干细胞对大多数传统的化疗药都耐药，正是白血病诱导缓解后复发的根源
2、。因此，设计针对白血病干细胞的有效治疗才能减少复发率，甚至治愈。就如下面将讨论的，开发针对白血病干细胞的特效药物将面对重大的挑战，因为它们的特点和正常造血干细胞十分相似。进一步研究白血病干细胞和正常造血干细胞的细小差别，以便研制出对前者毒性大而后者杀伤小的药物显得十分重要。在这章，我们将简单回顾造血干细胞和白血病干细胞的生物学特性。我们也将讨论目前正在进行的一些研究，如何利用已知知识发现针对白血病干细胞靶向治疗的方法，以减少白血病复发。正常造血干细胞的生物学特性造血干细胞是最早发现的人体干细胞。实验也支持造血干细胞的存在，它分化成自我复制能力减弱、增殖能力加强的定向细胞。实验研究证实淋巴祖细胞
3、和髓祖细胞是淋巴细胞和髓细胞系最早的分叉点。小鼠的研究对造血干细胞生物学特性的认识做出了重要贡献。首先经致死性放射线照射后，输注骨髓细胞后造血得到重建。注射10天后在小鼠的脾内发现多系细胞克隆形成，每一个克隆都是一个造血干细胞衍生而来。这些克隆又将进一步分化成新的次级克隆。Jones等研究发现导致小鼠造血重建失败的实验中，持续输注造血细胞时间过短。造血干细胞产生下游系列造血细胞完成造血重建需要一定时间，当输注的造血细胞如祖细胞产生克隆形成单元后逐渐凋亡，而具有自我更新能力的造血干细胞因数量较少尚未来得及产生下游细胞，造血就无法重建。因此，Morrison等认为小鼠的骨髓重建是必然的，并非偶然。
4、由于人造血干细胞研究的数量限制，目前我们所知道的人造血干细胞的知识多来自体外和人。虽然人造血干细胞与小鼠的存在重要差异，但是证据表明两者具有共同的基本特征如自我更新的能力、增殖能力、定向分化的能力。在体外试验中能评价造血干细胞的重要特性，如增殖能力，但多向分化、不断自我更新完成造血的能力难以精确地检测。严重联合免疫缺陷（severe combined immune-deficient,SCID）小鼠缺乏适应性免疫能力，非肥胖性糖尿病SCID小鼠（NOD/SCID）同时缺乏固有和适应免疫能力，能比体外检测更加精确地反应人造血干细胞的特性。体内检测的精确性可通过输注对照细胞进一步提高。造血干细胞的
5、免疫表型特征与定向的造血细胞和成熟血细胞比较，造血干细胞形态上有所不同。另外，造血干细胞能够通过多参数流式检测与造血祖细胞区分开来。最常用的富集造血干细胞的免疫标记是CD34。Terstappen等研究证实CD34+细胞中大约1%不表达CD38抗原。CD34+/CD38-细胞缺乏定向祖细胞特异性标记（Lin-）基本等同于我们期望纯化获得的多能造血干细胞。相比之下，CD34+/CD38+细胞异质性较强，包括髓系、红系和淋系祖细胞。这说明CD38+表达上调是造血干细胞向下分化的标记。在人胎绵阳模型中，CD34+/CD38-能产生多系的造血细胞维持造血持续进行，而CD34+/CD38+细胞只能短期地
6、造血，说明它代表只是多能造血祖细胞，而不是造血干细胞。这个研究说明CD34+/CD38-细胞具有很强的长期分化产生多系造血细胞的能力，意味着人体骨髓细胞中存在干细胞群。另外，造血干细胞还被发现表达高水平的干细胞抗原（SCA-1）和弥漫性糖蛋白（P-gp）,一种位于细胞膜的多药转运蛋白，由多药耐药基因1表达。另一方面，造血干细胞缺乏或低表达Thy-1.1,CD33,CD71,CD10,CD45RA和HLA-DR，而更加成熟的血细胞却常常表达这些抗原中的一种或多种。最后，Gunji等研究表明CD34+且c-Kit低表达的造血细胞包含有CD34+/CD38-细胞，而CD34+且c-Kit高表达细胞群
7、常包含有许多粒-单系祖细胞。造血干细胞表达CD34这一规律近年来被不断挑战，许多研究发现CD34-细胞同样可以完成造血重建。这些细胞多位于长期培养启动细胞（long-term culture-initiating,LTC-ICs）内。总而言之，我们在精确鉴定和筛选造血干细胞方面仍面对许多挑战，未来研究主要目标是确定造血干细胞特异性的标记物或组合，以便能从众多细胞中鉴定出造血干细胞。造血干细胞与造血微环境骨和血液形成机制传统观点认为是互不相干的，但是强有力证据表明两者联系密切。造血干细胞位于骨髓中，靠近骨小梁表面，称之为“壁龛”。越来越多证据表明位于“壁龛”中的 间质细胞，尤其是成骨细胞，在调节
8、造血干细胞自我更新、增殖、成熟方面发挥重要作用。虽然成骨细胞是主要的骨髓间质细胞，但其具体参与骨髓微环境调节造血的生物机制知之甚少。几个细胞表面受体在控制造血干细胞在骨髓中“壁龛”定位方面发挥重要作用。例如钙敏感受体（calcium-sensing receptor,CaR）.研究表明来自鼠胎肝的钙受体缺乏的造血干细胞无法植入到骨髓中。另外，这些细胞输注到致死性射线照射后小鼠体内，经无法迁移至骨“壁龛”中。由此可见，钙离子受体在造血干细胞归巢中起至关重要的作用。另外几个与造血干细胞归巢有关的细胞受体是化学趋化因子4（chemokine receptor 4,CXCR-4）和配体，间质细胞因子(
9、stromal-cell derived factor,SDF-1)。白血病干细胞两个有趣的观察说明了白血病干细胞的存在。首先，尽管髓细胞白血病具有高度恶性，其大部分白血病原始细胞只能在体内增殖，而仅有少量原始细胞可在体外形成克隆。其次，任何个体的白血病细胞尽管形态上十分相似，但其生物学特性存在很大差别。过去二十年，越来越多证据表明白血病克隆是由一小群干细胞即白血病干细胞，也被称为白血病启动细胞产生的。一些研究者认为白血病是一类新的异常造血干细胞即白血病干细胞产生的，这种异常的干细胞只能产生原始细胞，停止于细胞发育的某个阶段，不能往下分化。1994年Dick实验室的研究发现从AML患者中分离出
10、的CD34+CD38-细胞移植到免疫缺陷小鼠体内获得成功，第一次证明了白血病干细胞的存在。同一实验室后来发现更少量的CD34+CD38-在NOD/SCID小鼠即可诱导出急性髓细胞白血病。因此，作者认为白血病干细胞和造血干细胞一样具有增殖和分化、自我复制的能力，只不过分化产生的是白血病原始细胞。随后，白血病干细胞被证明同样存在于慢性髓细胞和急性淋巴细胞白血病。白血病干细胞仅是众多肿瘤细胞中的一小部分，通常以将其移植到免疫缺陷小鼠内能产生白血病的能力来对它进行定义。白血病干细胞具有造血干细胞的许多特征，如表1中所示。大部分化学药物都是周期特异性的，杀伤已分化的细胞，而通常不能清除白血病干细胞。另外
11、，白血病干细胞生物学特性上不同于由其分化产生的白血病细胞，它有着自己独特的细胞和分子机制调控其行为。所以，普通化疗药对白血病干细胞无效，这是治疗失败或缓解后复发的主要原因。另外，白血病干细胞和造血干细胞一样具有“药物泵”P-gp,可将化疗药物从细胞内转移到细胞外，从而逃避杀伤。表1.1 造血干细胞和白血病干细胞的共同特征处于静止期自我复制能力较强的增殖能力多向分化的潜能生长于“壁龛”之中抗凋亡表达CD34+/CD38+/CD71-/HLA-DR-/表达Bmi-1白血病干细胞的起源来自Dick实验室的数据表明白血病干细胞有着共同的CD34+CD38-表型，能分化、增殖和自我复制，由正常造血干细胞
12、发生白血病转化产生，而不是起源于造血祖细胞阶段。后来白血病干细胞必须来源于造血干细胞这一假说遭到挑战。定向造血祖细胞发生基因突变或选择性表达部分基因后可以增强其原本有限的自我复制能力，从而演变成白血病干细胞。事实上，多个研究报道通过向定向造血祖细胞转染特定的癌基因后可将其诱导成白血病干细胞。Cozzio等报道向白血病干细胞或粒-巨噬细胞方向分化的髓系祖细胞转染白血病融合基因MLL-ENL然后移植到小鼠体内可产生急性髓细胞白血病（AML）。这些发现说明短暂性自我复制能力的祖细胞经过MLL基因转化后可具备产生白血病的能力。这使得一些学者认为白血病干细胞因其来源细胞发生突变的阶段不一样，临床上不同白
13、血病患者细胞的免疫表型、病理特点存在差异。另外，Huntly等发现将癌基因MOZ-TIF2转入至造血祖细胞可诱发AML，但转入BCR-ABL融合基因却无法得到相同结果。这些数据表明仅部分而不是所有的白血病基因都能使无永久复制能力的祖细胞转化成白血病干细胞。后来，Stubbs等发现MLL-AF9和FLTS-ITD联合转染产生的AML恶性程度要高于单独转染MLL-AF9产生的 AML。这些结果支持白血病发生中的”二次打击”学说。第一次打击导致融合基因的表达（MLL-AF9），随后二次突变引起特定信号通路改变（FLT3-ITD）。但，应注意到所有关于白血病干细胞起源于祖细胞的数据都是来自动物模型。B
14、CR-ABL融合基因阳性的白血病干细胞在慢性髓细胞白血病（CML）中，成熟的白血病细胞及祖细胞与它们的正常成分在形态上没有多大区别，不同的是费城染色体或Bcr-Abl转录本存在于这些肿瘤细胞中。费城染色体是慢性髓细胞白血病的标志性遗传学异常，是由9和22号染色体长臂异位形成的。这种染色体异位形成的癌性激酶蛋白Bcr-Abl是CML发病的主要原因。费城染色体存在于几乎所有造血细胞系中，说明CML起源细胞具有多向分化的潜能。研究者将从CML患者体内分离出的CD34+ 恶性原始细胞注入到SCID或NOD/SCID小鼠体内可产生成熟的ph+ 细胞并完整重演供者疾病的各个时期，是一个很好的CML体内模型
15、。Holyoake等首先证实了CML中Bcr-Abl+/CD34+ 细胞亚群在体内和体外都具有干细胞特性。同一研究小组随后证实那些干细胞免疫表型为CD34+/CD38-/CD45RA-/CD71-，可离开G0期以非细胞因子依赖的方式产生BCR-ABL+子代细胞。伊马替尼的出现使CML的治疗有了质的飞跃，目前已成为该种疾病慢性期一线治疗的标准用药。但是仍有少部分慢性期及大多数加速期患者对伊马替尼无效或者很快失效。越来越多证据显示伊马替尼并没有清除体内的CML干细胞。完全细胞遗传学缓解患者体内仍可检测出ph+ CD34+ 细胞。这意味着多数CML患者并没有被伊马替尼根治，这关系到未来复发的问题。据
16、此，成功清除体内的CML干细胞才是治愈该疾病的根本途径。最常见的伊马替尼耐药机制是ABL基因突变。最近研制出的达沙替尼和尼罗替尼是对付这种耐药的好武器，为第二代TKI对CML治疗比伊马替尼更有效。但仍没有一个临床试验证实这些药物对CML干细胞起作用。除基因突变外，有几个机制被认为是与CML干细胞对TKI耐药有关，如IL-3受体、G-SCF受体、MDR1表达增加，伊马替尼吸收相关蛋白表达受抑制。BMS-214662是一种法尼基蛋白转移酶抑制剂，被显示在体外单药或联合伊马替尼、达沙替尼选择性诱导CML干细胞凋亡。具体作用机制涉及caspase3 、caspase 8的激活和MAPK信号通路的抑制等
17、。这一制剂为慢性期CML干细胞的清除提供可能，具有良好的临床试验前景。AML白血病干细胞能在NOD/SCID小鼠体内复制白血病的各种原始AML细胞亚群有着共同的独特免疫表型，尽管细胞来自不同的AML亚型患者，除急性早幼粒细胞白血病外，因为该种亚型目前还没发现确切的白血病干细胞表型。尽管个体之间存在异质性，多数AML干细胞具有与正常造血干细胞CD34+/CD38-/CD71-/HLA-DR-相同的表型。但两者也有不同之处，AML干细胞缺乏CD90、CD117表达，而IL-3受体CD123和CLL-1表达。另外，多数AML干细胞表达CD33，与正常造血干细胞比较CD44在AML和CML干细胞过表达
18、。总之，AML干细胞与造血干细胞具有共同特征外也有所不同，这恰好可成为针对白血病干细胞治疗的靶点。ALL白血病干细胞ALL干细胞的存在是个有争议的话题。和AML一样，ALL是一种高度异质性疾病，具有不同的临床和基因亚型。T细胞受体或免疫球蛋白重排支持T和B细胞ALL起源于T或B细胞定向祖细胞。ALL起源于淋系定向祖细胞由Castor等提出，他们证实了ETV6-RUNX1融合基因使定向B祖细胞发生白血病转化。Kong等从儿童B-ALL中分离出CD34+/CD38+/CD19+，CD34+/CD38-/CD19+和CD34+/CD38-/CD19-三群细胞注入到NOD/SCID小鼠体内，发现前两群
19、细胞可诱发B-ALL的发生，而第三种细胞群产生的是正常造血。白血病细胞在肝、脾和肾等脏器浸润程度，在前两种细胞亚群诱发的白血病中没有差别。另外，CD34+/CD38+/CD19+细胞亚群进行第二次移植仍可诱发白血病，因此作者认为这群细胞具有自我复制能力，是ALL干细胞。近年来，一些研究揭示部分ALL亚型，其白血病细胞来源于表型原始的造血干细胞，而不是淋系定向祖细胞。例如，在儿童前B-ALL中，细胞遗传学异常存在于CD34+/CD38-/CD33-/CD19-细胞亚群，说明ALL原始细胞来源于造血干细胞阶段。Cox等证实前B-ALL中的CD34+/CD10-/CD19-、T-ALL中的CD34+
20、/CD4- 和CD34+/CD7-细胞亚群可长期增殖。这说明在这些例子中，更原始表型细胞是白血病转化的目标。Viseur等发现在儿童ALL中，不同免疫表型阶段的细胞都可有干细胞特性。研究者将这些不同免疫表型成熟度的细胞移植到NOD/SCID小鼠体内可完全重建白血病表型。总之，ALL与AML 干细胞特点不完全相同。白血病干细胞靶向治疗许多基因突变、分子异常和信号通路紊乱是导致AML产生的原因。但关于这些异常是如何具体影响白血病干细胞知道得并不多。白血病干细胞发挥维持疾病存在的作用，因此应该将研究重点放在增殖、自我复制和生存的通路上。更明确点就是开发出靶向白血病干细胞生存通路而对正常造血干细胞损伤
21、甚小的药物(如表1.2所示)。白血病完全缓解后复发的主要原因是微小残留病灶（MRD）的存在。例如，vanRhenen等近 来发现特定免疫表型的AML干细胞在完全缓解后可在体内检测到，并且诊断时白血病干细胞数量与化疗后MRD数呈正相关，与患者生存呈负相关。此研究说明MRD可在白血病干细胞水平检测。表1.2 白血病干细胞的靶向治疗药物靶点 药物NF-B MG-132 硼替佐米 DMAPT TDZD-8PI3K 雷帕霉素 ET-18-OCH法尼基蛋白转移酶 BMS-214662壁龛 AMD3100 Anti-CD44靶向白血病干细胞生存通路白血病干细胞生存信号过强与异常的凋亡机制有关，调节这些异常信
22、号通路可能成为清除白血病干细胞的有效方法。在众多异常信号通路中，最重要的两条是NF-B和 PI3-kinase/AKT通路。未受刺激的造血干细胞不表达NF-B，而AML干细胞持续表达NF-B。NF-B是一种抗凋亡因子，使肿瘤细胞获得生存优势。Guzman等23研究发现蛋白酶体抑制剂MG-123，通过稳定细胞IkB对NF-kB信号抑制，进而诱导CD34+CD38+ AML细胞凋亡，对正常干细胞损伤甚小。TD-ZD8是糖原合酶3 b抑制剂，原用于治疗神经系统疾病，如Alzheimers，后被发现能抑制NF-kB活性。它是一种非ATP的糖原合酶3 b竞争性抑制剂，能抑制Cdk1/cyclin B、c
23、asein kinase-II、 PKA 、PKC活性，从而介导细胞死亡。Guzman等24发现TD-ZD8对原发性髓细胞白血病细胞、淋巴细胞白血病细胞等多种肿瘤细胞具有较强的杀灭作用。在NOD/SCID小鼠体内重建白血病克隆的实验表明，TD-ZD8可以使其不再具有长期重建白血病的作用，而对正常造血克隆在NOD/SCID小鼠体内重建却没有影响。哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）是磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）通路的丝氨酸-苏氨酸激酶，是PI3K通路的下游调节因子，控制细胞基因转录和分化。PI3K /Akt/mTOR信号通路在人类白血病细胞中持续激活，使用PI3K或mTOR抑制剂联合阿糖胞苷和依托
24、伯苷可诱导白血病细胞凋亡和减少LSCs的数量25-26。磷酸酶张力蛋白同系物（PTEN）是一种负性调节PI3K的脂质磷酸酶。在小鼠模型中，当它在造血干细胞缺失时，可引起以造血干细胞迅速增殖却失去自我更新能力为特征的MPD样综合征，并在六周内进展为AML或ALL27。用雷帕霉素预处理后小鼠被敲除PTEN基因后不再发展为白血病，对于建立白血病的小鼠，雷帕霉素可以延长其生存期，抑制白血病细胞的增殖，并影响其在在NOD/SCID小鼠体内重建白血病克隆的效率27。以上研究证实，雷帕霉素作为mTOR抑制剂可以根除PTEN缺失的LSCs。雷帕霉素及其他mTOR抑制剂用于白血病治疗的临床试验正在进行。靶向白血
25、病干细胞表面抗原和微环境运用抗体特异性作用于表达于细胞表面的分子是LSCs靶向治疗的一个重要策略。CD33是一种表达于正常髓系单个核细胞和AML原始细胞的粘附蛋白，近年被发现也表达于部分AML-LSCs。吉妥昔单抗，作为一种CD33的人重组的人源化单克隆抗体同时与细胞毒素连接，可诱导复发的CD33+AML 再次缓解，在APL中可以清除微小残留病灶28。吉妥昔单抗治疗作用中有部分是特异性杀伤CD33+的AML-LSCs。CD123，即IL-3受体，是又一个表达AML-LSCs的分子标记。Jin L等报道针对CD123的抗体7G3在体外试验中选择性杀CD34(+)CD38(-)白血病细胞，降低AM
26、L在NOD/SCID小鼠体内重建的效率，提示其对LSCs有杀伤作用29。CLL-1(C-typelectin-like molecule-1),是表达于许多LSCs表面功能不明的粘附分子10。在正常骨髓中，它只表达于CD38+的髓系祖细胞，CD34+CD38的干细胞不表达使之成为颇具吸引力的治疗靶点。虽然联合常规化疗和新的靶向治疗能完全清除外周血的恶性肿瘤细胞，但骨髓中残留的微小残留病灶常成为日后复发的根源。由此可见骨髓中的基质细胞必然对造血细胞的生存起保护作用。基质细胞衍生因子（SDF-1）与它的受体CXCR4之间相互作用在引导LSCs在骨髓中迁移起重要作用。Tavor S等30研究SDF-
27、1/ CXCR4对于维持LSCs生物学特性保护其生存的作用。用抗体先后阻断SDF-1和CXCR4的活性可缩短AML 细胞的生存时间并削弱了AML原始细胞在NOD-SCID小鼠体内重建白血病细胞克隆的能力。因此，SDF-1/CXCR4信号通路是一个很有前景的LSCs治疗靶点。VLA-4是表达于人AML细胞表面的一种蛋白，在骨髓微环境中介导白血病细胞与纤连蛋白、血管内皮细胞粘附分子-1的结合起重要作用。Matsunaga等31研究发现在体外VLA4+AML细胞与纤连蛋白接触后激发PIK3-AKT细胞通路，从而使细胞避免化学药物的诱导凋亡；给白血病克隆重建的小鼠体内注入VLA-4抗体和阿糖胞苷可清除
28、其微小残留病灶。CD44作为在LSCs过表达的粘附分子最近因为颇具希望的治疗靶点而成为大家关注的热点。CD44是一种广泛存在的跨膜糖蛋白，能够连接透明质烷、骨桥蛋白，在器官发育、细胞归巢、细胞移动方面起作用32。Jin等33最近研究发现将H90注射到获得人AML的NOD-SCID小鼠体内后，白血病负荷明显减小，且无法在其他NOD-SCID小鼠体内重建白血病克隆33。但正常造血干细胞或脐带血在NOD-SCID小鼠的移植却不受H90的影响。抗CD44抗体抗白血病作用机理之一是扰乱LSC与造血微环境之间的作用33。靶向白血病干细胞自我更新信号通路造血干细胞和白血病干细胞自我更新能力的调节机制目前知之
29、甚少，仅有的知识是通过动物模型研究得来的。自我更新的抑制可能导致白血病干细胞休眠而无的的毒性，同时有可能影响到正常造血干细胞。另一方面，阻断自我更新使分化压力增加，从而有利于清除白血病干细胞成分。基因Bim-1是在多种组织调节细胞生存的蛋白，其作用机制包括自我更新/增殖、移动/静止、细胞死亡的调节。在人和小鼠，Bim-1都被证实只在非常原始骨髓细胞中表达。Bim-1的表达对正常造血干细胞自我更新能力的维持至关重要。另外，Bim-1在所有髓细胞白血病都有表达，包括CD34+的白血病干细胞群。Bim-1缺乏的白血病干细胞和祖细胞增殖潜能受影响并不能在小鼠体内诱导出白血病，同时研究发现仅Bim-1基
30、因可完全纠正细胞增殖潜能的缺陷。这说明Bim-1基因直接调控着白血病干细胞的自我复制和增殖的能力。因此，靶向白血病干细胞的Bim-1基因治疗可能产生奇特的疗效。明白自我复制能力的分子调节机制关系到白血病和造血干细胞的生存问题是未来白血病干细胞靶向治疗的关键。Wnt信号通路也在造血干细胞自我复制和增殖方面起到重要的作用，它及其下游效应通路被异常激活常见于白血病中。这些研究发现提示Wnt信号通路是白血病转化中的一个重要环节，为白血病干细胞的靶向治疗提供帮助。结论白血病干细胞是肿瘤干细胞的典型代表，并且作为一模型让我们认识了肿瘤干细胞的一般生物学特性。白血病干细胞在白血病发生中的核心作用已被确立。它
31、与正常造血干细胞有着共同的特征，但也有自己独特的一面。两者之间的差异为靶向白血病干细胞治疗而正常造血干细胞损伤最小提供了可能。 第二节 白血病的传统诊断方法1急性白血病急性白血病是一种以造血原始细胞恶性克隆性增殖，但向功能性粒、单、淋巴和红细胞分化受阻，以致大量非成熟或原始细胞大量蓄积为特征的恶性血液肿瘤。依据原始细胞的来源，将其分为前B或T急性淋巴细胞白血病和急性髓细胞白血病，每一种都代表了一组高度异质性疾病。原始细胞同时表达两种以上或更多系列抗原的白血病不常见，此时将其定义为急性混合细胞性白血病。急性白血病患者的治疗决策依据为其精确的分类。形态学检测对疾病的分类十分重要，另外其他的检验，如
32、流式细胞仪检测免疫表型、细胞遗传学、分子基因检测也很常用。目前WHO关于急性髓细胞白血病和前体淋巴细胞肿瘤分类分别如下2.1表所示。除临床表现外，形态学、免疫表型、细胞遗传学和分子检测对急性白血病的精确诊断至关重要。急性白血病的诊断流程图如下。2.1 世界卫生组织的急性髓细胞白血病分类具有特定细胞遗传学异常的 伴随t(8;21)(q22;q22); RUNX1- RUNX1T1的AML 伴随inv(16)(p13.1q22)或t(16;16)(p13.1;q22);CBF-MYH11的AML 伴随t(15;17)(q22;q12);PML-RARA的AML 伴随t(9;11)(p22;q23)
33、;MLLT3-MLL的AML 伴随t(6;9)(p23;q34);DEK-NUP214的AML 伴随inv(3)(q21q26.2)或t(3;3)(q21;q26.2);RPN1-EVI1的AML伴随t(1;22)(p13;q13) 的AML伴随NPM1突变的AML 伴随CEBPA突变的AML 骨髓增生异常综合征相关的AML治疗相关性的AMLAML ,非特指类 微分化型的AML 伴成熟型的AML 无成熟型的AML 急性单核细胞白血病急性粒单核细胞白血病急性红白血病急性巨核细胞白血病急性嗜碱细胞白血病急性全髓增生症伴骨髓纤维化粒细胞肉瘤Down 综合征相关的髓细胞增殖性疾病暂时性的异常髓细胞增生
34、 Down 综合征相关性髓细胞白血病母细胞性浆细胞树突状细胞肿瘤AML： 急性髓细胞白血病2.2 前体淋巴细胞肿瘤的WHO分类B淋巴母细胞白血病/淋巴瘤，非特指型具有特定细胞遗传学异常的B淋巴母细胞白血病/淋巴瘤 伴随t(9;22)(q34;q11.2)的B淋巴母细胞白血病/淋巴瘤 伴随t(v;11q23) MLL重排的B淋巴母细胞白血病/淋巴瘤 伴随t(12;21)(p13;q22);TEL-AML1(ETV6-RUNX1)的B淋巴母细胞白血病/淋巴瘤 超二倍体的B淋巴母细胞白血病/淋巴瘤 亚二倍体的B淋巴母细胞白血病/淋巴瘤 伴随t(5;14)(q31;q32) IL-3-IGH的B淋巴母
35、细胞白血病/淋巴瘤 伴随t(1;19)(q23;p13.3) E2A-PBX1(TCF3-PBX1)的B淋巴母细胞白血病/淋巴瘤T淋巴母细胞白血病/淋巴瘤1.1急性髓细胞白血病目前WHO分类标准中，AML包括四大类：具有基因异常的AML；MDS转化性、治疗相关性髓系肿瘤；非特指性AML。非特指性AML诊断十分强调形态学、细胞分化和成熟程度，如既往的FAB分型一样。分子和遗传基因研究使依据WHO标准对急性白血病精确分类成为可能。按照WHO诊断标准，AML诊断要求外周血或骨髓中原始细胞数量超过20%。如果特定的基因异常被确定存在，不管原始细胞比例多少都可以做出诊断。如果骨髓中红系祖细胞比例超过50
36、%，原始细胞比例计算仅在非红细胞中进行，这对诊断急性红白血病十分重要。在AML中，原始细胞包括髓、单、红系三大类。1.1.1骨髓活检和穿刺涂片AML患者骨髓活检显示增生活跃的原始细胞不同程度代替正常造血组织。原始细胞在骨髓呈均匀分布或片状分布。大多数患者原始细胞大小相对一致，呈圆形或椭圆型，凹陷切迹或瘤突状，胞浆量不均一。骨髓穿刺涂片呈现的髓白血病细胞大小、核形、胞浆量有所差异。原始细胞常有多个核仁，AML白血病细胞的一大特征是伴有Auer小体，表现为天蓝色颗粒，较多见于伴有t(15,17)(q22;q12)、t(8;21)(q22;q22)染色体异常的AML；单核原始细胞常较大，呈圆形或椭圆
37、形，染色质松散、核仁明显，胞浆嗜碱，量中等或丰富；原红细胞呈嗜碱性，核圆，染色质浓缩、核仁差异大；原巨核细胞大小不等，胞浆丰富，可伸出伪足。巨核细胞白血病活检可发现明显网状纤维，骨髓穿刺时常出现干抽；免疫组化对疾病的诊断有重要价值。1.1.2 细胞化学反应急性白血病分类的重要依据之一是原始细胞的细胞化学反应。大于3%原始细胞呈现过氧化物酶阳性反应，说明是髓系白血病。醋酸酯酶有助于分析单核系来源细胞，如果原始细胞过氧化物酶阴性，非特异性酯酶阳性，可做出急性单核细胞白血病诊断。急性微分化白血病过氧化物酶阴性，但表达髓系抗原。1.1.3 流式细胞仪检测流式细胞仪检测白血病细胞免疫表型，是急性白血病实
38、验室诊断的重要组成部分，往较免疫组化和细胞化学检测更快得到结果。超过90%的急性白血病患者细胞来源及具体的分化方向都可通过流式细胞仪分析出来，但这并能代替基于形态学的原始细胞比例计算，因为流式细胞仪检测的少量细胞并能完全反应骨髓中的白血病细胞分布情况。白血病免疫特征欧洲研究组提出了抗原系列积分系统，近年WHO对它作出了修改。在这修改后的积分体系里，CD3表达提示T淋巴系列，CD19、CD79a、CD22 、CD10 表示B淋巴系来源，MPO或单核标记出现暗示髓系来源。1.2急性淋巴细胞白血病依据最近修订的WHO关于造血和淋巴系统肿瘤分类标准，急性淋巴细胞白血病是一类高度恶性的疾病，外周血或骨髓
39、中超过20%的原始淋巴细胞浸润。共分为三大类：B淋巴细胞白血病/淋巴瘤 非特指；伴有遗传学异常的B淋巴细胞白血病/淋巴瘤；T淋巴细胞白血病/淋巴瘤。1.2.1骨髓活检和穿刺涂片急性淋巴细胞白血病骨髓中正常造血细胞减少代以大量单个核的白血病性原始或幼稚淋巴细胞。低增生性急淋骨髓象少见。FAB 急性淋巴细胞白血病(ALL)的分型标准中，按细胞大小将ALL分为L1、L2、L3亚型。吉姆萨染色的骨髓细胞图片中， ALL原始淋巴细胞体积变化大，染色质细致，可见12个核仁，细胞核常有分叶和裂隙，胞浆可有嗜天青颗粒，但无Auer小体。L1为形态学上较成熟的原始淋巴细胞，体积较小，大小较一致，核浆比例高，核边
40、界清晰，核仁小而不清，12个核仁，胞浆少，色淡；L2型属较不成熟和多形性的原始淋巴细胞，形态差异大，核浆比例低，胞浆量多，核仁差异大；L3型以大细胞为主：绝大多数原淋细胞体积大小一致，染色质细致均匀，核仁清晰，12个，胞浆多而深蓝，有许多大小不等的空泡，可充满胞浆中。由于L1或L2形态特点不能用于预测免疫表型、染色体核型、临床结局，因此在最新的WHO分类中已不再涉及形态学特点。1.2.2细胞化学尽管目前尚无一个独特的细胞化学反应可用以诊断急性淋巴细胞白血病，但MPO、非特异性酯酶反应阴性而TdT阳性这一组合是ALL的典型细胞化学反应结果。当然，少数ALL病例也可表达微弱的MPO，TdT也可在少
41、数AML患者表达。超过95%的L1和L2患者TdT阳性，相比之下L3 ALL 很少TdT阳性。TdT在区分反应性淋巴细胞增生和L1型ALL方面很有价值。L1-ALL细胞形态上和反应性淋巴细胞增生类似，但通常TdT为阴性。尤其当标本极少时，如脑脊液中淋巴细胞性质的鉴定。1.2.3流式细胞仪急性淋巴细胞白血病大部分是B系来源，常见的免疫表型是CD19+、CD22+、CD79a+。免疫表型抗原谱与白血病细胞分化的成熟度有明显相关性：早前B-ALL CD19+、CD22+、CD79a+、TdT+，而普通B-ALL细胞表达CD10，胞浆IgM见于前B-ALL中，成熟B白血病细胞表达膜免疫球蛋白和CD20
42、，但不表达TdT。CD34、CD20表达无明显特异性，可见于各阶段细胞。大约15%的急性淋巴细胞白血病为T细胞来源，其分类依照正常胸腺不同发育阶段分为早T-ALL，膜CD3阴性，但胞浆CD3阳性，而CD4、CD8双阳性或双阴性；相对成熟T细胞白血病膜CD3阳性，CD1a阴性，CD4或CD8阳性或都为阴性。ALL细胞合并髓细胞表面抗原表达并不常见，在t(9;22)、t(4;11)染色体易位患者中发生率相对较高，而CD33、CD13是常见的合并表达髓系抗原，CD117及其罕见。虽然早期研究显示合并髓系抗原表达的ALL预后较差，近来研究发现预后差别并无统计学差异。CD117表达被认为是完全反应率低，
43、患者可从AML的治疗中获益。2.1骨髓增殖性疾病慢性骨髓增殖性疾病是以一系或多系髓系细胞克隆性增生为主要特殊的一组高异质性疾病。世界卫生组织(WHO)将慢性骨髓增殖性疾病(chronic myeloproliferative disease,CMPD)分为慢性粒细胞白血病、慢性中性粒细胞白血病、慢性嗜酸粒细胞白血病、肥大细胞增多症、真性红细胞增多症、慢性特发性骨髓纤维化、特发性血小板增多症和CMPD不能分类。虽然这种疾病具有高度异质性，但它也一些共同特征用于鉴别MDS、MDS/MPN、急性白血病等其他髓系肿瘤。MPN的特点是一或多系细胞克隆性增殖，以致外周血中大量有效、成熟的粒细胞，相比之下M
44、DS却是无效、病态的造血细胞，急性白血病则为非成熟异常血细胞的恶性增生。不同的骨髓增殖性疾病之间在临床病理特点上有一定的重叠，明显升高的粒细胞、红细胞、血小板及肝脾肿大为常见的病理特征。荧光原位杂交技术（FISH）开展检测特定的发病基因在MPN的诊断中发挥越来越重要的作用（如下图所示）。在本节中将重点阐述慢性髓细胞白血病。2.1.1慢性髓细胞白血病1845年首次报道该疾病，现已成为运用分子技术进行诊断和评价疗效、判断耐药的疾病典范。Nowell和Hungerford鉴定费城染色体是CML的特征性遗传学异常，而Rowley发现了费城染色体的本质是9号染色体上ABL1基因和22号染色体上BCR易位
45、融合成的BCR-ABL1基因。WHO将CML定义为骨髓增殖性疾病，起源于异常的多能造血干细胞，与BCR-ABL1融合基因有关。据此，可将CML与所有良性疾病或类似恶性疾病进行鉴别诊断。该疾病可发生于任何年龄，但很少发生于20岁以下，男性发病比例偏高。类似于其骨髓增殖性疾病，CML通常有慢性期、加速期和急变期，各个时期的具体界定标准目前仍存在较大争议，但无论如何慢性期患者治疗效果较加速、急变期要好。慢性期CML的骨髓象特点是髓系各阶段细胞数量占绝对优势；巨核细胞数量有时也增加，但体积常较小，数量增加的组织细胞胞浆丰富，另外常见嗜碱和嗜酸性细胞；原始细胞数量在正常范围内，并随疾病进展而增加。骨髓纤
46、维化程度不同患者差异较大，但在疾病早期常较轻。加速期CML的诊断标准包括白细胞数难以下降或治疗后再升高，血小板减少，脾肿大，嗜碱细胞比例超过20%或原始细胞比例10%-19%。因为近年来，CML的治疗进展迅速，以上部分判断标准的临床意义受到质疑。当骨髓或外周血中原始细胞比例超过20%，急变期诊断基本无争议。急变期原始细胞形态在不同患者差异很大，约70%患者为髓系分化的细胞，其次为淋巴系细胞占20%，还有10%病例为巨核系、红系的。尽管流式细胞仪检测免疫表型在慢性髓细胞白血病慢性期诊断时价值不大，但确定免疫表型在诊断疾病加速和急变期时至关重要。3慢性淋巴细胞白血病及淋巴增殖性疾病慢性淋巴细胞增殖性疾病典的型特点是形态成熟的淋巴细胞克隆性增殖。该病的诊断需要结合临床、形态学、免疫表型和分子、遗传学特点。本节重点介绍慢性淋巴细胞白血病，其他类似疾病可以此为参考。 慢性淋巴细胞白血病是B淋巴细胞的恶性克隆性疾病，其重要的实验室和临床诊断要点是持续性的外周血淋巴细胞数大于5*109/L超过3个月，具有克隆性增值的证据且符合特定免疫表型。CLL骨髓增生活跃，淋巴细胞显著增多，形态基本与外周血一致，原始淋巴细胞一般