第7章核酸化学.ppt

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1、第七章 核酸化学,大连大学生命科学与技术学院 吴海歌,核酸的发现和研究进展,1868年 F.Miescher从脓菌细胞核中提取“核素”，后被称为脱氧核糖核酸(DNA) 1944年 Avery等人证实DNA是遗传物质 1953年 Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构,被誉为生物学和遗传学史上的里程碑。 1958年 Crick提出了分子生物学中心法则； 1961年 提出操纵子学说 1966年 Nirenberg等发现遗传密码 1970年 Temin和Baltimore发现核酸逆转录酶，补充了中心法则。 1975，1976年 Gilbert和Sanger等建立DNA测序技术 1986年 美

2、国启动人类基因组计划(HGP) 1999年 中国加入人类基因组计划，承担1%的测序任务 目前 完成人类基因组计划全部测序工作，已进入后基因组时代。 1994年 澳大利亚学者提出“蛋白质组”。,本章主要内容,第一节 核酸的化学组成； 第二节 核酸的一级结构（DNA、RNA）； 第三节 DNA的空间结构与功能； 第四节 RNA的空间结构与功能； 第五节 核酸的理化性质与应用； （形状、大小、吸光度、变性、复性、 分子杂交、核酸酶等） 第六节 核酸的生物学功能和意义； 第七节 核酸的分离、合成和鉴定,第一节 核酸的化学组成 pp.478,核酸(nucleic acid) 一种多聚核苷酸 以核苷酸为基

3、本结构单元，通过3,5磷酸二酯键连接形成多聚核苷酸链。 一种生物大分子，可携带和传递遗传信息，指导蛋白质生物合成。,核酸的分类及分布,(deoxyribonucleic acid, DNA),(ribonucleic acid, RNA),脱氧核糖核酸,核糖核酸,分布：90%以上存在于细胞核中，其余在核外，如线粒体，叶绿体，质粒等处。,分布：胞核(10%)、胞液(90%),功能：遗传信息的载体，决定细胞和生命个体的基因型。,功能：参与DNA遗传信息表达。 病毒RNA也可作为遗传信息的载体。,一、核酸的化学组成 pp.478,The Chemical Component of Nucleic A

4、cid,1. 核酸组成,（1）元素组成 C、H、O、N、P（910%） （2）核酸分子的三大组成成分： 碱基(base)： 嘌呤碱，嘧啶碱 戊糖(ribose)：核糖，脱氧核糖 磷酸(phosphate),核酸的特征元素,核酸分解产物 pp.478,DNA和RNA间的区别主要在于核糖和碱基,碱 基 pp.479,嘌呤(purine),腺嘌呤(adenine, A),6,嘧啶(pyrimidine) pp.479,稀有碱基,稀有碱基特点： A,G,C,U,T的甲基化产物，在核酸合成后，由甲基化酶催化进行甲基修饰而成。 存在量稀少，tRNA中含量较多，约5%左右； 细胞中含有一些游离嘌呤衍生物，如

5、：次黄嘌呤、黄嘌呤等。 目前已知稀有碱基有近百种。 pp.479,次黄嘌呤,注意：含有酮基的嘌呤或嘧啶均含有酮式和烯醇式结构，且处于二者平衡状态。,核糖和脱氧核糖,1,1,2.核苷的结构 pp.480,（1）核苷的组成 碱基 + 核糖(脱氧核糖)， 通过核糖C1位和碱基中的N原子相连，形成N-型糖苷键，形成核苷(脱氧核苷)。 核 苷：AR, GR, UR, CR 脱氧核苷：dAR, dGR, dTR, dCR,3.核苷酸的结构与命名 pp.481,核苷（脱氧核苷）和 磷 酸以磷酸酯键连接形成核苷酸（脱氧核苷酸）。 核苷酸： AMP, GMP, UMP, CMP 脱氧核苷酸： dAMP, dGM

6、P, dTMP, dCMP,在RNA分子核糖的环中2、3、5位含自由羟基，均可与磷酸结合，形成2-核苷酸、3-核苷酸、5-核苷酸。 在DNA分子中均为2位脱氧，因此，只有3、5位核苷酸。 生物体内主要存在5-核苷酸。,组成DNA、RNA的核苷酸特点,二、体内重要的游离核苷酸 及其衍生物,一磷酸或多磷酸核苷酸： NMP，NDP，NTP 3,5环状核苷酸: cAMP，cGMP,AMP、ADP、ATP结构 pp.481,ADP,3,5-cAMP,3,5-环状一磷酸腺苷 （激素的媒介、第二信使）,pp.482,含有核苷酸的生物活性物质,NAD+、NADP+、CoA-SH、FAD 等中均含AMP,第二节

7、 核酸的一级结构 pp.482,核酸分子中核苷酸的排列顺序。 核苷酸区别在于碱基 也称碱基序列,3,5-磷酸二酯键连接而成的多核苷酸链； 无分支。 pp.483,DNA、RNA的一级结构 pp.483-484,核酸链要点：,核酸骨架：磷酸-核糖， 碱基为侧链； DNA、RNA区别： DNA组成：脱氧核糖、碱基、磷酸 DNA碱基：A、G、C、T； RNA组成：核糖、碱基、磷酸 RNA碱基：A、G、C、U； 具方向性(极性)：5-磷酸、3-OH 阅读方向：3端5端,简便书写法,5 pApCpTpGpCpT-OH 3,5A C T G C T 3,书写规则：从左到右 5在左侧，含磷酸基； 3在右侧，

8、含OH。 强调碱基顺序。,pp.482,第三节 DNA的高级结构与功能,Dimensional Structure and Function of DNA,pp.485,一、 DNA的二级结构右手双螺旋结构 pp.486,（一）研究背景和历史意义 背景和依据： X-衍射结果显示： DNA呈规律性螺旋结构； 核酸分子组成的定量关系（A=T，G=C)； DNA具有种属特异性，不具有组织特异性；不同种类生物体DNA碱基组成不同，同种来源不同组织的DNA分子碱基组成相同； *意义：DNA双螺旋结构揭示了基因结构、遗传信息和功能之间的关系。使结构学派、信息学派和生化遗传学派得到了高度的统一，开创了生命科

9、学研究的新时期，推动了分子生物学和遗传学的迅速发展。,碱基组成特点： A=T；G=C A+G=C+T（嘌呤=嘧啶） A+C=G+T（氨基碱基=酮基碱基） 碱基配对原则： (Chargaff规则) pp.486 碱基以氢键配对 A = T（两个氢键）； G C（三个氢键） 此特点对DNA双螺旋结构模型的提出起到了重要作用。,两条反向平行的多聚脱氧核苷酸链，以右手螺旋方式绕同一中心轴盘绕； 脱氧核糖-磷酸链骨架在双螺旋外侧； 碱基居双螺旋内側，与对側碱基通过氢键互补，形成碱基平面。垂直螺旋轴，即： A=T; GC (称碱基对,base pair,bp),（二）DNA双螺旋结构模型特征(要点） （W

10、atson-Crick模型,1953） pp.486,多聚核苷酸链的正方向为C3C5； 螺旋平均直径为2nm，形成大沟和小沟相间； 相邻碱基平面间距离：0.34nm；螺距：3.4nm （近期测定：3.6nm)； 每10(10.5)bp形成一个螺旋，每个bp旋转约36o角。,DNA碱基对的氢键和键长,三个氢键连接，两链间距离较狭窄,两条氢键连接， 两链间距离较宽松,pp.487 图4-5,氢键：维持双链横向稳定性； 碱基堆积力：维持纵向稳定性，疏水力和范德华力； 磷酸上负电荷与介质中阳离子间形成盐健； 前面两种力均为： GCAT GC含量多的DNA片段横向纵向均稳定。,维持DNA双螺旋结构稳定的

11、三种力,（三）DNA结构的多样性 pp.488,1.双螺旋的多样性 A-型：双连反向右手，较紧密，11bp/周； B-型：Watson-Crick模型，常见，10.5bp/周； Z-型：左手双螺旋，锯齿形；以(GC)n含量多，紧密；12bp/周；真核和原核DNA中均有存在；,Z-DNA B-DNA A-DNA,二、DNA三级结构 pp.490,DNA携带遗传信息大分子 不同的生物体DNA分子不同，复杂程度也不同。进化程度越高，DNA越复杂，分子量也会越大。 真核线状DNA分子形成双螺旋后，虽然发生紧缩，但仍无法进入细胞核，因此必需进一步紧缩。,（一）DNA的超螺旋结构 pp.490-,DNA来

12、源不同，分子大小也不相同。 病毒DNA进入病毒外壳、细菌染色体DNA进入胞内核区、人类46条染色体DNA进入细胞核，这些长度极大的DNA分子必须经过多层次扭曲、盘绕，压缩成紧密结构(超螺旋)，才能完成安装任务。,（1）DNA超螺旋结构 pp.491,DNA双螺旋链的再盘绕，即螺旋轴本身扭曲。 是DNA结构张力的一种表现。 正超螺旋(positive supercoil) 张力过度，盘绕方向与DNA双螺旋方同相同 负超螺旋(negative supercoil) 张力不足，盘绕方向与DNA双螺旋方向相反 图13-12,（2）DNA拓扑学性质 pp.491,拓扑学研究相互绕在一起的环在几何形态上的

13、相互关系的学说。 用三个参数表示： L(总连环数)共价闭合环状DNA两链缠绕次数； T(盘绕数)：螺旋轮数； W(超螺旋数)：双螺旋绕超螺旋轴旋转次数。 DNA拓扑学关系式： L=T+W （在DNA复制、转录过程起重要作用）,DNA超螺旋结构意义,超螺旋的拓扑学变化及其调控对于DNA复制和RNA转录具有重要意义。 例如：拓扑异构酶能通过引入或解除超螺旋来调节超螺旋程度，从而影响DNA的复制和转录时的解链过程。,（二）DNA在细胞内的组装,（1）原核生物DNA高级结构 原核DNA多为闭环双螺旋结构，在此基础上再次螺旋化，形成超螺旋结构。,（2）真核生物细胞核内DNA形式,真核生物核染色体：DNA

14、+蛋白质 pp.494 分裂期 棒状（染色体） 染色体DNA + Pr(组蛋白) DNA超级结构， 基本单位核小体。 核小体的组成： DNA： 约200bp 组蛋白：H1；H2A，H2B；H3；H4,蛋白质数量：2(H2A,H2B,H3.H4) 形成八面体,两个核心颗粒之间再由60个bp(碱基对）和H1形成连接区，将核心颗粒和H1连成串珠结构。,核心颗粒,核心颗粒,pp.495,三、DNA结构与功能的关系,1、确定DNA是遗传物质的试验(肺炎球菌） pp.475,+,+,T2噬菌体感染大肠杆菌 同位素试验,标记的T2与大肠杆菌混合感染,充分搅拌使菌体表面T2与菌体分离,离心，检测上清和沉淀中放

15、射性元素情况,T2在侵染细菌时仅DNA进入菌体，Pr外壳没进入。,新病毒中仅有32P,没有35S存在。,35S标记T2蛋白质,35S在悬浮液中,32P标记T2DNA,32P在沉淀菌体内,证明,pp.476,DNA是以基因的形式运载遗传信息，作为复制、转录的模板,2.基因DNA分子上的一段序列,结构基因能编码多肽链或RNA的DNA片段。DNA分子中还含有其他序列，它们不编码蛋白质，是纯粹的调节序列。 调节基因(调节序列)可提供下列信号，发挥调节功能： 指示结构基因的开端和结尾； 参与结构基因转录的启动和关闭； 具有复制、重组起点的作用。 基因由DNA上一段编码肽链或转录RNA的序列(结构基因)，

16、和调节序列共同组成。,3.双螺旋提供了遗传信息传递基础,DNA双螺旋性质为半保留复制提供了结构基础。 细胞分裂时，按照碱基互补原则，以亲代DNA每条单链为模板合成与其互补的子链DNA（如图）。,4.基因指导蛋白质合成,反向平行的双螺旋也可以在DNA和RNA链之间形成，叫做DNA-RNA杂交链。在杂交分子中基因将信息准确地传递给RNA，并可指导蛋白质合成。杂交链的碱基配对规则： DA-RU、DG-RC、DC-RG、DT-RA 碱基配对的应用：出现在复制中，产物为DNA； 出现在转录中，产物为RNA 细胞内RNA(mRNA、tRNA和rRNA)都是以DNA为模板转录产物。 DNA和蛋白质之间的联系

17、物是RNA。,分子生物学中性法则（遗传信息流传递方向）,以亲代DNA为模板，通过 碱基配对原则，复制生成子 代DNADNA复制； 以DNA单链某一基因片段为模 板，通过碱基配对原则合成 RNARNA转录； 以mRNA为模板，以过多种RNA配合，通过密码子的翻译，指导合成蛋白质翻译。 RNA病毒在宿主细胞中繁殖时，以其RNA为模板，通过碱基配对原则，在逆转录酶催化下，合成DNA，称为逆转录过程。,DNA不仅可以指导复制DNA，也指导转录合成能与DNA链互补的RNA链。 按照Crick中心法则，在信息表达时，编码蛋白质的基因可将信息转录给mRNA。再以mRNA为模板指导合成蛋白质。,DNA 5-A

18、-G-A-G-G-T-G-C-T-3 3-T-C-T-C-C-A-C-G-A-5,mRNA 5-A-G-A-G-G-T-G-C-T-3,蛋白质 -ArgGlyAla,转录和翻译,模板链,在mRNA线性序列上每三个核苷酸为一个遗传密码，编码一个氨基酸。因此，mRNA的核苷酸序列确定了蛋白质的氨基酸序列。 基因的遗传信息通过RNA的中间传递，最终以蛋白质的形式表达出来。发挥蛋白质生物学功能和特性。 即：基因表达,四、DNA的序列分析,测定DNA核苷酸序列的基本原则： 获得高纯度、均一完整的DNA基因片段； 用DNA限制性内切酶降解，获得一套大小不同片段； 测定每个片段的核苷酸序列； 完整DNA分子

19、的拼接。 核酸的测序，是测定碱基序列过程。 与蛋白质的氨基酸测序原则类似。,五、DNA限制性内切酶,催化外源DNA中某特定部位水解的酶类。 （一）细菌DNA的限制、修饰系统： 降解外源DNA特异部位，修饰内源DNA相同部位。 即：菌体除含有降解外源DNA分子的酶外，还含有对内源DNA分子中限制性内切酶识别部位修饰保护作用的酶类。 限制：破坏外源DNA 修饰：保护内源DNA,修饰：多由专一性甲基化酶完成 甲基化酶（对内源DNA保护）与限制性内切酶（对外源DNA降解）作用于同一部位。 宿主甲基化酶和限制性内切酶往往成对存在。 （二）限制性内切酶 两种类型： 类型具有降解酶、修饰酶、ATP酶功能；

20、类型仅具有降解酶功能。,限制性内切酶类型切割部位特点：,4-6bp特定序列，呈双重对称 例如：EcoR识别降解部位可产生黏性末端 EcoR识别降解部位可产生平齐末端,E：大肠杆菌（E coli）；co：种名的字头；R：Ecoli的株系；罗马字母：酶的编号,六、DNA测序的链终止法 (pp.518-519),采用DNA复制原理 在DNA模板、引物、4种5-dNTP及酶促合成所需要的其他所有条件下： DNA聚合酶在模板指导下，以3,5-磷酸二酯键结合的方式依次将单个5-dNTP连接到引物或新合成链的3-OH上，依次合成，从而得到与模板互补的DNA新链。 当向3-OH端加入的5-dNTP时，若同时加

21、入3-OH被H取代物，则部分DNA新链合成便被终止。,由于终止部位是随机的，所以可以获得任何一种长度的DNA片段。 通过电泳分离，再经放射自显影，从胶片上直接可读出核苷酸顺序(如图)。 此法简便、快速且准确。 链终止法关键： 2,3-ddNTP与dNTP的含量比。 ddNTP/dNTP比值恰当，可保证合成终止在所需位置。,GGCCATCGTTGA,2,1,3,4,链终止法测定DNA序列-电泳图谱,与膜板DNA互补序列,pp.519,1,2,3,4,5,6,7,9,8,10,10 GGCCATCGTTGA,10 GGCCATCGTTGA,10 GGCCATCGTTGA,七、DNA分子大小特点和分

22、析,DNA生物大分子 病毒DNA：几千bp 细菌DNA：几百万bp 真核染色体DNA：几千万bp,核酸的研究方法,分子杂交法 电子显微镜观察法 核酸复性动力学研究法 DNA、RNA核酸测序法 研究揭示了许多核酸的组织结构特点。,第四节 RNA的结构与功能 pp.483,Structure and Function of RNA,除上列RNA外，还有多种RNA存在于细胞中，如： 核内小RNA(SnRNA)，主要参与HnRNA的剪切与转运； 核仁小RNA(SnoRNA)，主要参与rRNA的加工与修饰。,RNA的结构与功能,RNA结构： 多以单链形式存在， 有局部二、三级结构； 相对分子量（Mr.）

23、： 几十几千个核苷酸残基 RNA功能： 几种RNA共同完成基因表达(蛋白质合成)任务,一、信使核糖核酸（mRNA） 的结构与功能,1.mRNA的特证： mRNA基因的携带者，含编码区和非编码区 编码区(结构基因)指导蛋白质合成； 非编码区调控蛋白质合成的起始与终止； mRNA量：约占细胞总RNA量的5%； 不稳定，细菌mRNA半衰期仅几分钟； mRNA多以一级结构形式存在。,2. 原核生物mRNA特征,含非编码区； 含多顺反子 非编码区不为蛋白质编码的核苷酸序列 单顺反子一个基因仅携带为一条肽链编码 的核苷酸序列(信息）。 多顺反子一个基因携带为多条肽链编码的全部核苷酸序列。每个顺反子编码一条

24、肽链,非编码区，多为核糖体识别位点, mRNA的3端和5端均存在一段非编码区。 非编码区功能调节基因的开放与关闭； 原核生物mRNA含多顺反子，每两个顺反子间被非编码区隔开；,单顺反子,单顺反子, 原核生物mRNA的SD序列,原核mRNA起始密码AUG上游(左侧)约10核苷酸处，有一段富含嘌呤的核苷酸序列，称为前导序列。 (Shine-Dalgarno发现，因此命名，并称其为SD序列 ) SD序列功能：与翻译的起始密切相关，是mRNA与核 糖体小亚基中16S rRNA 结合的部位。,3.真核细胞mRNA特征 pp.484,真核生物mRNA中只有单顺反子，但在其两端也存在非编码区。如下图。, 真

25、核生物mRNA的内含子和外显子 真核mRNA合成初期的HnRNA中存在不编码蛋白的内含子和编码蛋白的外显子。在成熟加工过程中，需将内含子切掉，将外显子连接起来，形成成熟的mRNA分子(如图):,真核生物mRNA的成熟与转移, 真核mRNA结构特点 pp.484,a.5末端帽子结构：m7G5ppp5Nm- 转录后加工上去的：7-甲基鸟苷二磷酸 有些第一个核苷酸残基的G2也被甲基化。 b.多数真核mRNA的3末端有多聚A尾：polyAn 转录后加工上去的：-AAAAAA-An,帽子结构：m7GpppNm- pp.484,帽子结构的功能： 协助mRNA与核糖体识别，为mRNA翻译的起始提供识别标志，

26、防止5末端降解起保护作用。,4.mRNA的功能,DNA携带的遗传信息，通过碱基配对原则转录到mRNA分子上，然后，再以mRNA为模板，在核糖体上指导合成蛋白质。,二、转运核糖核酸（tRNA） 的结构与功能,1.tRNA的一级结构特点 含稀有碱基(10-20%)，如：二氢尿嘧啶环(DHU)； 3末端为-CCA-OH，氨基酸结合位点； 氨基酸臂有较多的 GC 结构(稳定)； 在TC环中含假脲嘧啶()-胸腺嘧啶(T)-核苷酸环； 含反密码子环（反密码子与密码子反向识别）。,稀有碱基,氨基酸臂（富含GC，且有-CCA-OH3); 二氢尿嘧啶（DHU）环； 反密码子环（7个碱基，中部的3个核苷酸残基形成

27、反密码子与密码子反向识别）； 额外环(不同的tRNA，此环大小不同，有一定的种属特异性）； 假尿嘧啶-胸腺嘧啶（TC）环（7个核苷酸残基，含TC成分）。,2.tRNA的二级结构三叶草型 pp.496,tRNA的三级结 倒L形结构,tRNA的功能 活化、转运氨基酸； 通过反密码子识别密码子； 并将AA运输到核糖体中，参与蛋白质合成。,pp.177,反密码子,氨基酸臂,5端,3端,三、核糖核蛋白体核糖核酸(rRNA) 的结构与功能 rRNA细胞中含量最多的RNA,约占80%,rRNA的结构(如图） 功能： rRNA可与蛋白质结合，形成核糖体；为蛋白质生物合成提供场所。 (如下表),pp.498,核

28、糖核蛋白体的组成 pp.498,第 五 节 核酸的理化性质与应用,The Physical and Chemical Characters of Nucleic Acid and its application,pp.502,一、核酸的溶解性,1.有机溶剂分离： 核酸分子中因含有许多极性基团， 例如：-OH、-NH2、-PO43- 等； 易溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。 用70%乙醇可将核酸从水溶液中沉淀分离,2.低盐溶液分离核酸-蛋白复合物：,胞内DNA、RNA常以蛋白质复合物形式存在： 如：DNA-蛋白质(DNP)、RNA-蛋白质(RNP) DNP在低盐溶液中溶解度很低，RNP溶解度

29、较高。 例如：DNP在0.14molL-1的NaCl中的溶解度仅为水中的1%，但RNP却极易溶解。所以可用于分离。,二、核酸的紫外吸收特点 pp.507,核酸在紫外光区具有强烈的吸收，其最大吸收值在260nm附近；因此，通过A260可初步测出核酸含量。 原理：碱基含有共轭双键； 蛋白质在280nm附近具有特征吸收，因为含有Tyr和Try残基(含共轭双键的芳香烃侧链)； 用紫外光对核酸定量时应注意固定pH： 固定pH稳定解离状态稳定空间结构得到稳定的A260值。,判断核酸纯度 pp.507,较纯的DNA：A260/A280=1.8 较纯的RNA： A260/A280=2.0 当样品中含有杂蛋白质

30、时：A260/A280 当样品中含有RNA时：A260/A280 纯品可用A260定量测定其含量： 通常：A260=1 时： 双链DNA=50g/mL；单链DNA(或RNA)=40g/mL 或寡聚核苷酸20g/mL,各种碱基的紫外吸收光谱（pH7.5）,A,C,G,T,U,消光系数,波长,A260,三、DNA的变性(denaturation) pp.508,DNA变性在某些理化因素作用下，DNA双链间H键断裂，形成两条单链的过程。 条件：过酸、过碱，加热，变性剂(如尿素、 酰胺等)以及某些有机溶剂等。,增色效应： DNA变性时，使溶液A260增高的现象。,解链曲线：,在连续加热DNA过程中，以

31、A260T作图，得到一条曲线解链曲线。,热变性,A260nm,解链温度(Tm)：DNA变性是在一个很窄的温度范围内完成。在变性范围内，A260=1/2A260时对应的温度（解链一半时对应温度）。称为DNA的解链温度，又称熔解温度(Tm)。 特点： TmG+C 均质DNApolyd(G-C) 或polyd(A-T)熔解 范围窄，反之则较宽； 介质中离子强度高， Tm也高，熔解范围窄； 反之，离子强度底， Tm也低，熔解范围 则较宽。,pp.508,DNA变性后理化性质变化：,A260增高、溶液粘度下降、比旋光度下降、浮力密度升高、酸碱滴定曲线改变、生物活性丧失等。,四、DNA的复性与分子杂交 p

32、p.509,1.DNA复性(renaturation)： 在适当条件下，如解除变性因素，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一过程称为复性，也称退火。 如：热变性DNA缓慢降温复性 影响复性因素：浓度、温度、链长 减色效应： DNA复性时，A260 降低的现象。,2.核酸分子杂交(hybridization) pp.510,在DNA复性时，如果将不同种类的DNA单链或RNA分子放在同一溶液中，两单链核酸分子之间存在一定程度的碱基配对关系。在适宜条件下，便可在两分子间发生互补结合，形成杂化。 杂化可以在DNA与DNA之间形成、DNA和RNA之间、RNA与RNA分子间形成。被称为核酸分

33、子的杂交。,3.DNA印迹技术（Southern blotting) pp.510,RNA和蛋白质印迹法 pp.511,Northern blottingRNA印迹技术 将变性RNA转移到硝酸纤维素膜上，加入32P标记的RNA或DNA探针，通过杂交，检测的方法。 Western blotting蛋白质印迹技术。根据抗原-抗体相结合原理，通过标记，进行检测的方法。,总 结,核酸的组成、结构、种类和特点；DNA和RNA功能；碱基的种类；核苷，核苷酸；NMP、NDP、NTP；dNMP、dNDP、dNTP；核酸的紫外吸收特征；35-磷酸二酯键;核酸的3端、5端特点； DNA的二级结构右手双螺旋结构要点

34、及稳定力；碱基配对原则；分子生物学中心法则；内切酶、外切酶； RNA的种类、结构与功能；真核细胞mRNA的结构特点、tRNA的结构（二级）特点及功能；rRNA的功能； 核酸的紫外吸收特点（260nm）DNA的热变性（双链解开，松散，黏度下降，紫外吸收增强-增色效应）、复性（双链恢复双螺旋，黏度增加，紫外吸收降低-减色效应）；解链温度（或融解温度，Tm）；Tm与碱基种类及含量的关系；核酸分子的杂交及其应用；核酶；,碱基配对原则（DNA-DNA；DNA-RNA；RNA-RNA）； 分子生物学中心法则； DNA分子的测序（链终止法原理）； 基因重叠，真核mRNA的内含子，外显子，回文结构。,RNA的

35、分类 mRNA的结构与功能 编码序列、非编码序列、 原核：多顺反子 真核：单顺反子、内含子、外显子、帽子结构、尾巴结构。 功能：做为模板，指导合成蛋白质。 tRNA结构与功能 含较多的稀有碱基；二级结构为：三叶草型(氨基酸臂、反密码子环） 功能：在反密码子的识别下，转运氨基酸，为合成蛋白质提供原料；每种tRNA仅携带一种特定的AA。 rRNA的结构与功能：颈环结构,分子杂交检测技术的应用,DNA的变性和复性；分子杂交； DNA印迹技术（Southern blotting) RNA印迹技术Northern blotting； 蛋白质印迹技术Western blotting,三、核苷酸的紫外吸收特

36、性 pp.507,核苷酸碱基(共轭双键)紫外区具有强烈的吸收峰240-290nm，最大吸收峰位260nm左右。可用作定性定量检测。 影响因素： 碱基种类；解离状态。在不同pH下紫外吸收光谱不同(如图)。测定紫外吸收时应注意pH要固定。,核苷酸的定性与定量分析 定性分析紫外吸收标准比值法: 各种核苷酸在特定pH条件下紫外吸收的标准比值(A250/A260、A280/A260、A290/A260)是固定的。因此，可分别测定未知样品在固定pH条件下的250nm、260nm、280nm和290nm的吸光度，经计算对比，可基本确定其核苷酸种类； 定量分析摩尔吸光系数法： 某核苷酸在260nm处的摩尔吸光

37、系数， 与pH相关。 因此，使用时应固定pH。,四、核苷酸的两性解离 pp.505,碱基杂环中氮(N)原子及取代基具有接受质子和给出质子的能力，所以它们即具有碱性解离又具酸性解离的性质。 核苷酸中磷酸基也是可以解离的。 因此，核苷酸也有等电点。 解离基团的pK值是可查的。,（一）基因重叠,基因重叠指不同基因在 核苷酸序列上相互重叠 的现象。(如图) 分析表明： A蛋白与B蛋白；D蛋白与E蛋白的 氨基酸序列均是不同的；但其基因碱基序列却具有一定的重叠性。原因：阅读框架发生了变化。,在同一段DNA序列上获得不同蛋白质信息的原因是：采取不同阅读方式的结果。 即：阅读三联体密码的起始点不同、阅读框架移

38、位所致。 基因重叠现象是否有普遍性目前还在研究中。,DNA和RNA杂交观察及核苷酸序列对比发现： 许多真核生物DNA基因片段与其转录RNA长度不等。 原因： 在真核生物基因中存在一段或几段非编码序列(插入序列）。即一个结构基因可被插入序列断开形成断裂基因。 基因的编码区外显子 基因的非编码区内含子,（二）插入序列,原核mRNA：核苷酸序列是其模板DNA序列精确互补链(无插入及断裂问题)； 真核mRNA：其基因是由外显子和内含子（插入序列）相间排列而成的，成熟的mRNA是其前体剪去插入序列后拼接而成。 mRNA前体(前体RNA或不均一RNA，HnRNA) 基因初级转录产物，经加工(如：除去内含子等)后的形成成熟mRNA。,（三）回文序列,一种对称性重复序列（反向重复），多出现在DNA非编码区； 在一假想轴的两侧顺同一极性阅读，两条链的某些碱基序列是相同的，可表现出双重对称。 可形成链内发卡式结构或十字结构(如图)。 许多DNA限制性内切酶识别位点为回文结构,End,